La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo
Summary
Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.
Abstract
– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3′ con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3′ y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.
Introduction
miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación con el tamaño grande mensajero RNAs, que han demostrado ser afectados críticamente por FFPE procesamiento de tejido (formaldehído, calor, desecación, etc.), RNasas endógenas y la edad de las muestras, el tamaño pequeño de miRNAs (~ 18-24 nucleótidos) parece hacerlos resistentes al almacenamiento a largo plazo, también se demostró mediante estudios de expresión de miRNA que superan los estudios de mRNA de alto rendimiento en especímenes archivados9y resistente a la degradación. estudios de expresión de miRNA utilizando muestras clínicas archivadas, que en su mayoría se han realizado análisis en pequeña escala, han demostrado que solo o multiplexado ensayos PCR cuantitativos, diferentes tipos de tecnologías microarrays y más recientemente NGS puede utilizarse para evaluar la expresión de miRNAs conservada después de la optimización de estos ensayos10,11,12,13,14.
Dado que la desregulación de la expresión del miRNA se ha asociado con el desarrollo de una variedad de malignidades humanas y que es potencialmente una fuente enorme de clínico anotado muestras archivadas, se ha puesto de manifiesto que estos ARN pequeño las moléculas representan una fuente prometedora de potenciales biomarcadores de cáncer15,16,de17,18. El uso de una tecnología de expresión de gen de alto rendimiento como NGS tiene la ventaja de proporcionar una evaluación global de todas las transcripciones de miRNA en comparación con tecnologías específicas tales como PCR y microarrays de19. Por esta razón, se ha optimizado un protocolo optimizado, asequible y fácilmente aplicable para la preparación de la biblioteca del cDNA de ARNs pequeños de más viejos especímenes archivados para NGS para estudios a gran escala20.
Anteriormente establecimos un protocolo de extracción de ARN/ADN simultánea para recuperación separada de ARN y ADN de ejemplares archivados más viejos, que hemos encontrado para superar a kits comerciales contemporáneo21. Utilizando este protocolo de extracción, para obtener el ARN total de tejidos FFPE archivados durante un período prolongado de tiempo, hemos optimizado la preparación de las bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs conservado en las muestras clínicas de hasta 35 años. Además, en un estudio recientemente publicado donde preparamos las bibliotecas de cDNA de clasificados clínicamente carcinoma ductal en situ muestras (CDIS), identificamos diferencialmente expresado miRNAs que fueron validados por PCR cuantitativa, que indica que cambios de expresión de miRNA específico pueden ser detectables en las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama en comparación con las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama.
Teniendo en cuenta el costo de los kits comerciales para la preparación de pequeñas bibliotecas de cDNA RNA, el potencial de su interrupción, así como el uso de reactivos protegidas por derechos de autor/patentes que no se pueden optimizar, decidimos adaptar previamente publicados en laboratorio y sin kit de 3′ barras cDNA biblioteca preparación protocolo para NGS de small RNAs en especímenes FFPE, lo que permite el análisis simultáneo de 18 muestras de22. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso ideal y robusto con puestos de control de evaluación visual y técnico, que eran críticos para la adaptación a las muestras de RNA FFPE, y tiene un gran potencial para su aplicación a otras fuentes de peligro o dificultad utilizar material de RNA. Aplicabilidad del protocolo original fue mejorada mediante la sustitución de marcadores de tamaño radiactivo marcado con fluorescente (p. ej., oro de SYBR) detectable RNA tamaño los marcadores usados durante la selección de bibliotecas ligadas en geles de poliacrilamida grandes. Este protocolo optimizado se basa en la ligación de código de barras adaptadores de 3′ a 18 muestras individuales de FFPE ARN, que son luego agruparon para someterse a la ligadura de 5′ adaptador, reverso-transcripción y un piloto análisis PCR para amplificación del cDNA final adaptado biblioteca antes de la amplificación, purificación y NGS a gran escala de PCR en un secuenciador de alto rendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22
Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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