Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben
Summary
Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Proben stellen eine wertvolle Quelle der molekularen Biomarker der menschlichen Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Labor-basierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll, zunächst mit frisch gefrorene RNA entworfen und optimiert für die Analyse von archivierten Mikrornas aus Geweben bis zu 35 Jahre gespeichert.
Abstract
– Archiviert, klinisch klassifiziert Formalin fixierten bieten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Nukleinsäuren Retrospektive Molekulare Studien der Krebsentstehung. Durch die Verwendung nicht-invasive oder Pre-maligner Läsionen von Patienten, die später invasive Erkrankungen entwickeln, helfe Genexpressionsanalysen frühe molekulare Veränderungen zu identifizieren, die für Krebsrisiko prädisponieren. Es wurde gut beschrieben, dass Nukleinsäuren FFPE Gewebe erholt unterzogen haben, schwere körperliche Schäden und chemischen Veränderungen, die ihre Analyse schwierig und erfordert in der Regel angepasst Assays. Micro-RNAs (MiRNAs), jedoch die repräsentieren eine kleine Klasse von RNA-Molekülen überspannt nur bis zu ~ 18 – 24 Nukleotide, haben gezeigt, dass langfristigen Lagerung standhalten und wurden erfolgreich in FFPE-Proben analysiert. Hier präsentieren wir Ihnen ein 3′ Barcode komplementäre DNA (cDNA) Bibliothek Vorbereitung Protokoll speziell optimiert für die Analyse von kleinen RNAs extrahiert aus den archivierten Geweben, die kürzlich unter Beweis gestellt wurde, robust und hoch reproduzierbare wenn mit archiviert klinische Proben bis zu 35 Jahre lang aufbewahrt. Diese Bibliothek Vorbereitung ist gut geeignet für die Multiplex-Analyse von Material beeinträchtigt/beeinträchtigt, wo RNA-Proben (bis 18) mit einzelnen 3′ Barcode Adapter ligiert und dann gebündelt für nachfolgende enzymatische und biochemischen Vorbereitungen vor der Analyse. Alle Reinigungen erfolgen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), die Größe-spezifische Auswahl und Bereicherungen des Barcodes kleine RNA-Spezies ermöglicht. Diese cDNA-Bibliothek-Vorbereitung ist gut angepasst an winzige RNA-Eingänge, wie eine pilot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bestimmung eines bestimmten Verstärkung-Zyklus zur optimale Mengen an Material für Next Generation Sequencing (NGS) produzieren erlaubt. Dieser Ansatz wurde optimiert für den Einsatz von degradierten FFPE-RNA aus Proben, die bis zu 35 Jahre archiviert und hoch reproduzierbare NGS-Daten bietet.
Introduction
MiRNAs sind bemerkenswert gut in Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Exemplare1,2,3konserviert. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass der Ausdruck dieser kurzen regulatorischen nichtcodierende einzelne gestrandeten RNA-Moleküle können erfolgreich mit Gesamt-RNS aus FFPE-Proben ausgewertet werden und liefern relevante Genexpressionsdaten im Vergleich zu den ursprünglichen frisch Gewebe4,5,6,7,8. Im Vergleich zu Großformat-Messenger-RNAs, die erwiesenermaßen FFPE Gewebe Verarbeitung (Formaldehyd, Hitze, Austrocknung, etc.), endogene RNases und das Alter der Proben, die geringe Größe der MiRNAs (~ 18 – 24 kritisch betroffen sein Nukleotide) wird angezeigt, damit sie resistent gegen Abbau und anfällig für langfristige Lagerung, auch durch MiRNA Ausdruck Studien, die Hochdurchsatz-mRNA Studien in archivierte Exemplare9übertreffen demonstriert. MiRNA Ausdruck Studien mit archivierten klinischen Proben, die vor allem in kleinen Analysen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass einzelne oder Multiplex quantitative PCR-Assays, können verschiedene Arten von Microarray Technologien und zuletzt NGS verwendet werden, um den Ausdruck der erhaltenen MiRNAs nach der Optimierung von diesen Tests10,11,12,13,14bewerten.
Da die Dysregulation des MiRNA Ausdruck mit der Entwicklung einer Vielzahl von menschlichen Tumoren verbunden wurde und gibt es möglicherweise ein enormer Vorrat an klinisch Archivierte Exemplare kommentiert, klar geworden, dass diese kleine RNA Moleküle sind eine vielversprechende Quelle potentiellen Krebs Biomarker15,16,17,18. Die Verwendung einer Hochdurchsatz-Gen-Ausdruck-Technologie wie NGS hat den Vorteil, dass eine Gesamtbewertung aller MiRNA Transkripte im Vergleich zu gezielten Technologien wie PCR und/oder Microarrays19. Aus diesem Grund wurde eine optimierte, kostengünstige und leicht anwendbaren Protokoll für cDNA Bibliothek Vorbereitung der kleinen RNAs aus älteren Archivierte Exemplare auf NGS optimiert, um groß angelegte Retrospektive Studien20ermöglichen.
Wir zuvor etabliert eine gleichzeitige RNA/DNA Extraktion Protokoll für separate Wiederherstellung von RNA und DNA aus älteren Archivierte Exemplare, die wir gefunden, um zeitgenössischen kommerziellen Kits21übertreffen. Verwenden dieses Protokoll Extraktion, um total RNA aus FFPE Gewebe archiviert für längere Zeiten zu erhalten, haben wir optimiert die Vorbereitung der cDNA-Bibliotheken für NGS MiRNAs in klinischen Proben bis zu 35 Jahre lang aufzubewahren. Darüber hinaus in einer kürzlich veröffentlichten Studie, wo wir cDNA-Bibliotheken von klinisch klassifizierte duktalen Carcinoma in Situ (DCIS) Proben vorbereitet, identifizierten wir differentiell exprimierten MiRNAs, die durch quantitative PCR validiert wurden gekennzeichnet werden Veränderungen der spezifischen MiRNA nachweisbar bei DCIS Läsionen von Patienten, die an Brustkrebs im Vergleich zu DCIS Läsionen von Patienten, die nicht an Brustkrebs erkranken.
Betrachtet man die Kosten der kommerziellen Kits für die Zubereitung von kleinen RNA-cDNA-Bibliotheken, das Potenzial für ihre Einstellung, sowie die Verwendung von Copyright/patentrechtlich geschützte Reagenzien, die optimiert werden kann nicht, haben wir uns entschlossen ein zuvor veröffentlichten anpassen Labor-basierte und Kit-freie 3′ Barcode cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs archiviert in FFPE-Proben, Proben ermöglicht simultane Analyse von 1822. Dieses Protokoll bietet eine ideale und robuste schrittweise Prozedur mit optischen und technischen Bewertung Checkpoints, die entscheidend für die Anpassung an FFPE RNA-Proben waren, und hat ein starkes Potenzial für die Anwendung auf andere Quellen von gefährdeten oder schwer RNA-Material verwenden. Das ursprüngliche Protokoll Anwendbarkeit wurde verbessert, indem radioaktiv markierte Größe Marker mit Leuchtstofflampen (z. B.SYBR Gold) nachweisbar RNA-Größe-Markierungen, die bei der Auswahl der aufgespaltenen Bibliotheken auf große Polyacrylamid-Gel verwendet. Dieses optimierte Protokoll stützt sich auf die Unterbindung der Barcode Adapter 3′ 18 einzelnen FFPE RNA-Exemplare, die sind dann gebündelt um 5′ Adapter Ligatur zu unterziehen, Reverse Transkription und ein pilot PCR-Analyse für Verstärkung der endgültigen cDNA zugeschnitten Bibliothek vor großen PCR-Amplifikation, Reinigung und NGS auf einen hohen Durchsatz-Sequenzer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein hoch reproduzierbare und robuste cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs in FFPE RNA-Proben archiviert wird in diesem Protokoll dargestellt, der eine modifizierte und optimierte Version des Verfahrens von Hafner Et Al. beschrieben ist 22
Alle Schritte dieses Protokolls wurden für den Einsatz mit älteren archiviert und kompromittierten Gesamt-RNS erholt aus FFPE-Proben optimiert. Der entscheidende Schritt dieses Protokolls für die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Thomas Tuschl, Leiter des Labors für Molekulare Biologie der RNA sowie Mitglieder von seinem Labor für ihre Unterstützung und für die gemeinsame Nutzung der Technologie entwickelt in seinem Labor und Zugriff auf die RNAworld-Pipeline. Wir danken auch Dr. Markus Hafner für sharing sein Protokoll und detaillierte Beschreibungen über alle biochemischen und enzymatische Schritte in seine ursprüngliche Verfahren verwendet.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
