성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

Summary

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정⁺ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

Abstract

동안 CD133⁺ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정⁺ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는⁺ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명⁺ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.

Introduction

CD133⁺ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인^1,2,3 수는 CD133⁺ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘^4,5,,67에 의해 신호의 활성화.

30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론⁴. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음^5,,89의 기관에 의해 방해 된다. 추가 CD133의 엔지니어링⁺ SCs 사전 이식 이러한 난제를 극복 도움이 될.

효율적인 세포 치료에 대 한 전제 조건 치료 관련 셀¹⁰engraftment를 향상 시키기 위해 대규모 초기 세포 죽음의 감소 될 것 이다. 현재 연구 시연 첫 1-2 h, 이식된 세포 유형의 독립적인 동안 매우 끼얹는다 뇌와 심장 등 장기에 90-99%의 엄청난 셀 손실 또는 응용 프로그램 경로^{11,12,13 14,15,16,17,18,19,,2021}. 관심^{22,23,,2425,26의 사이트에 대상 셀에 혁신적인 비-침략 적 전략을 가능 하 게 SC 마그네틱 나노 (MNPs)를 사용 하 여 라벨} 고 동시에 셀 MRI²⁷ (MPI) 이미징 자성 입자를 사용 하 여 모니터링 하는 것을 허용 한다. 가장 효율적인 vivo에서 정 맥 주입^{23,,2428 후 셀 지도 보다 로컬 관리 후 사용한 셀 보존 대상 적용 자성된 셀 연구} . 따라서, 우리의 그룹 superparamagnetic 산화 철 나노 입자²⁹의 구성 된 배달 시스템을 설계. 이 기술로, CD133⁺ SCs와 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 대상 효율적으로 수, 여 체 외에 시도^30,31.

사우스 캐롤라이나 요법에 대 한 또 다른 장애물 초기 세포 죽음³²에 기여 하는 이식 후 영향을 받는 조직의 적대적인 염증 성 환경입니다. 여러 사전 컨디셔닝 연구 뿐만 아니라 치료 관련 미르의 응용 프로그램은 테스트³³; 그것은 성공적으로 입증 되었습니다 안티 apoptotic 미르 생체 외에서 apoptosis를 억제 고 vivo에서세포 engraftment³³을 강화. 이 작은 분자, 20-25의 뉴클레오티드로 구성 메신저 RNAs (mRNAs)의 posttranscriptional 변조기로 서 중요 한 역할을 하 고 따라서 줄기 세포 운명과 행동³⁴를 영향을. 또한, 미르 세 도입 호스트 게놈³⁴에 원치 않는 안정적인 통합을 하지 마십시오.

기본 SCs에 핵 산 (NAs)의 효율적인 도입에 대 한 현재 시도 주로 재조합 바이러스^8,35기반으로 합니다. 높은 transfection 효율에도 불구 하 고 재조합 바이러스 조작은 벤치를 머리 맡 번역, 예를 들면, 통제 유전자 발현, pathogenicity, immunogenicity, 및 insertional mutagenesis^{35에 대 한 주요 장애물이 선물 ,36}. 따라서, 폴리머 기반 구조 등 비 바이러스 성 전달 시스템 개발에 중요 하다. 그 중에서 polyethylenimine (페이) 저하, 세포질 통풍 관에서에서 보호 하기 위해 나 결로 등 미르에 대 한 혜택을 제공 하는 유효한 배달 차량 나타내고 endosomal 통해 세포내 릴리스 탈출^37,38. 또한, 미르-페이 단지 임상 시험³⁹높은 생체 적합성을 설명 했다. 따라서, 우리의 배달 시스템은 biotinylated의 구성 분기 25 kDa 페이는 streptavidin 입히는 MNP 코어^30,,3140에 바인딩된.

이 원고에서는 CD133의 (i)는 수동 격리를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 소개⁺ 사우스 캐롤라이나 사우스 캐롤라이나 제품과의 효율적이 고 부드러운 transfection 전략 (ii)의 상세한 묘사와 인간의 골 수 (BM) 기부에서 한 자석으로 비 바이러스 성 고분자 기반 배달 시스템 CD133의 유전 공학에 대 한⁺ SCs 미르를 사용 하 여. CD133⁺ SCs 격리 되며 표면 항 체 기반 자기 활성화 셀 정렬 (맥) 시스템을 사용 하 여 인간의 sternal BM aspirates에서 자석으로 농축. 이후에, 세포 생존 능력 뿐만 아니라 셀 순도 cytometry 사용 하 여 분석 된다. 그 후, 미르/PEI/MNP 단지 준비가 CD133⁺ SCs는 페. transfection 후 18 h, 통풍 관 효율성과 transfection SC 마커 표현과 세포 생존 능력에의 영향 분석 된다. 또한, transfection 복잡 한 화합물의 세포내 분포의 평가 4 색 레이블 및 구조화 조명 현미경 (SIM)를 사용 하 여 수행 됩니다.

Protocol

셀 격리에 대 한 sternal 인간 BM 헬싱키 선언에 따라 연구에 대 한 그들의 샘플을 사용 하 여 그들의 서 면된 동의 준 정보 기증자 로부터 얻은 것입니다. Rostock의 대학 윤리 위원회 제시 연구 (등록 번호 A 2010 23, 2015 년에 연장)을 승인 했습니다. 1. 세포 준비 참고: BM 시험에 대 한 응고를 방지 하기 위해 헤 파 린 나트륨 (250 IU/mL BM)를 사용 합니다. <stron…

Representative Results

수동 격리와 인간의 BM 파생 CD133의 자석 농축 제시 프로토콜 설명+ SCs 후속 바이러스 독립 셀에 체 외에서 세포 조작 및 에 대 한 비-침략 적 기술 전략, 엔지니어링 vivo 모니터링 도구. 이 3 단계 절연 기술 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 미리 소화 sternal BM에서 MNCs의 분리를 허용합니다. 이후에, CD133<…

Discussion

최근 몇 년 동안, CD133⁺ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험^{43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , …}

Materials

7-AAD	BD Biosciences	559925
Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies	7060	3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)	Miltenyi Biotec GmbH	130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)	BD Biosciences	560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2	BD Biosciences
BSA	Sigma-Aldrich GmbH	A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-049
collagenase B	Roche Diagnostics GmbH	11088831001
counting chamber	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1	Ambion	AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit	Mirus Bio	MIR 9650
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	10104159001	(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope	Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield	Sigma-Aldrich GmbH	F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS pre-separation filter	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407	30 µm
MACS separation column (MS / LS)	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-302
Millex-HV PVDF Filter	Merck	SLHV013SL	0.45 μm
mouse IgG 2b-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll	Pan Biotech GmbH	P04-60500	density: 1.077 g/mL
PBS	Pan Biotech GmbH	P04-53500	without Ca and Mg
PEI	Sigma-Aldrich GmbH	408727	branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100 μg/mL
PFA	Merck Schuchardt OHG	1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1	Ambion	AM17110
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Pan Biotech GmbH	P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100	Stemcell Technologies	2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000	Stemcell Technologies	9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles	Promega Corporation	Z5481
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich GmbH	T8154	0.4 %
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software	Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath	Bandelin electronic		Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz