Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Summary

På tværs af en bred vifte af tegn på sygdom, mere fysiologisk relevante modeller bliver udviklet og implementeret i drug discovery programmer. Den nye modelsystem beskrevet her demonstrerer hvordan tredimensionale tumor spheroids kan kulturperler og screenes i en høj overførselshastighed 1536-godt plade-baseret system til at søge efter nye onkologiske lægemidler.

Abstract

Kræftceller har rutinemæssigt blevet kulturperler i to dimensioner (2D) på en plastik overflade. Denne teknik, men mangler den sande miljø en tumor masse er udsat for in vivo. Solide tumorer vokser ikke som et ark fastgjort til plastik, men i stedet som en samling af klonede celler i en tre-dimensionelle (3D) plads interagere med deres naboer, og med forskellige rumlige egenskaber, såsom forstyrrelser af normal cellulære polaritet. Disse interaktioner forårsage 3D-kulturperler celler til at erhverve morfologiske og cellulære karakteristika, som er mere relevante for i vivo tumorer. Derudover en tumor masse er i direkte kontakt med andre celletyper såsom stromale og immun celler samt den ekstracellulære matrix fra alle andre celletyper. Matrixen deponeret består af makromolekyler såsom kollagen og fibronektin.

I et forsøg på at øge oversættelse af forskningsresultater i onkologi fra bænken til bedside, er mange grupper begyndt at undersøge brugen af 3D-modelsystemer i deres stof udviklingsstrategier. Disse systemer er anset for at være mere fysiologisk relevante, fordi de forsøger at sammenfatte de komplekse og heterogene miljø af en tumor. Disse systemer kan dog være ret kompliceret, og selv om imødekommenhed over for vækst i 96-brønd formater, og nogle nu selv i 384, de tilbyder få valgmuligheder for omfattende vækst og screening. Dette observeret gap har ført til udviklingen af de metoder, der beskrives her i detaljer at kultur tumor spheroids i en høj overførselshastighed kapacitet i 1536-godt plader. Disse metoder udgør et kompromis for de yderst kompleks matrix-baserede systemer, som er vanskelige at skærmen og konventionel 2D assays. En lang række kræft cellelinjer husly forskellige genetiske mutationer er med held screenet, undersøge sammensatte effektivitet ved hjælp af en kurateret bibliotek af forbindelser rettet mod Mitogen-Activated Protein Kinase eller MAPK pathway. Klumpformet kultur svar er derefter sammenlignet med svar af celler dyrkes i 2D, og differential aktiviteter er rapporteret. Disse metoder giver en unik protokol for afprøvning sammensatte aktivitet i høj overførselshastighed 3D omgivelser.

Introduction

I det seneste årti, har flere og flere undersøgelser gennemført brugen af 3D celle kultur modeller til at forstå begreber, som ikke er fuldt sammenfattet af voksende celler i 2D på plastik. Eksempler på disse koncepter omfatter vekslen i normale epitelcelle polaritet¹ hvor den rumlige orientering af apikale og basal lag af celler går tabt, samt rollen, den ekstracellulære matrix i reguleringen af overlevelse og celle skæbne. Onkologi forskning, navnlig har brugt 3D modeller til at forstå grundlæggende biologi kræftceller og forskellene mellem 2D og 3D celle kultur systemer^3,4. Udviklingen af mere avancerede celle kultur teknikker og deres yderligere tilpasning til multi godt formater har aktiveret søgen efter nye stoffer i 3D-indstillinger. I modsætning til celler dyrkes betingelser 2D, 3D-modeller af tumorer varierer i kompleksitet fra lagdelt mobiltelefonsystemer⁵ til single-celletype områder af forskellige størrelser, til komplekse multi-cell-type kugler^{6,7, 8}. opdagelsen af nye forbindelser eller biologics, der potent inducerer celledød i disse 3D-modelsystemer er derfor af stor interesse i stof udvikling kampagner. Slutpunkterne på disse assays ofte er identiske med dem som i 2D kulturer til at vurdere ændringer i celledelingen, men da gennemført i en mere fysiologisk relevante indstilling, de kan afsløre den sande niveau af afhængighed af target gen eller pathway bliver afhørt.

Som indført ovenfor, en række modelsystemer er blevet udviklet for at studere medicin svar i 3D kultur systemer, men fleste bruger enten 96 eller 384-godt mikrotiter plader og er ikke let at tilpasse til high throughput screening (HTS) formater ofte bruges i Drug discovery screening kampagner. Sådanne systemer omfatter brugen af hængende droplet teknologier, klumpformet kulturer, pulserende celler med magnetiske partikler til at fremkalde levitation og kulturer indarbejde naturlige eller syntetiske geler som kollagen, Matrigel eller polyethylenglycol (PEG)² . Her præsenterer vi de detaljerede metoder til en tidligere udviklet teknik til at producere 3D klumpformet kulturer fra etablerede kræft cellelinjer i 1536-godt plade format. I denne protokol, er et meget defineret medium anvendes som forhindrer udlæg i normalt vedhængende celle linjer⁹. Dette system har begrænsninger (dvs., det kan ikke fuldt sammenfatte en kompleks modelsystem af kræft), men alligevel, disse assays aktiverer en høj overførselshastighed screening af store samlinger af små molekyler og krydsende sammenligninger af narkotika svar mellem 2D og 3D kulturer mod en række cellelinjer og forbindelser.

Cellelinjer valgt for at vise metoder i denne artikel alle harbor mutationer i gener relateret til MAPK signalering vej, en vej, som er meget dysregulated i kræft, og for hvilke mange therapeutics er tilgængelige. Mange af linjerne har aktiveringen muterede mutationer i Kirsten rotte sarkom virus også benævnt KRAS, Neuroblastoma RAS eller de nationale tilsynsmyndigheder, Harvey rotte sarkom virus onkogen eller HRAS og de tilknyttede kinaser hurtigt accelereret fibrosarkomer, også kendt som RAFs. Seneste litteratur tyder på, at forskellige noder af denne vej-hæmmere er entydigt mere virkningsfuldt i et undersæt af cellelinjer, når de dyrkes under 3D betingelser^9,10. En undersøgelse viste, at når kræftceller med aktive RAS var kulturperler i 3D, de viste en øget følsomhed over for MAPK hæmmere, og yderligere, at denne tilgang kunne identificere veje og målrettet hæmmere, der kan blive savnet i det traditionelle 2D indstilling. Målet med denne undersøgelse er at præsentere metoder til kultur disse cellelinjer, og yderligere, for at demonstrere differentieret svar til disse hæmmere, som kan observeres, når ved hjælp af 3D celle kultur systemer.

Protocol

1. dyrkning af 1536-godt 3D Tumor Spheroids Forberede en frisk 3D tumor klumpformet medium stilk, (celle medium + knockout serum udskiftning + insulin-transferrin-selen) ved at tilføje de følgende reagenser til 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicillin/streptomycin, 10 ng/mL af human Basic fibroblast vækstfaktor (bFGF), 20 ng/mL af human epidermal vækstfaktor (EGF), 0,4% bovint serumalbumin (BSA) (brøkdel V), 1 x insulin-transferrin-selen, og 1% knockout (KO) serum udskiftni…

Representative Results

En række etablerede kræftcelle linjer kendt for at vokse godt på 2D kultur betingelser blev testet ved hjælp af de metoder, der er skitseret her. Repræsentative billeder fra en bred vifte af MAPK mutant kræft cellelinjer (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS og KNS-62:HRAS) ses i figur 1. Disse billeder viser, at selv om cellelinjer har forskellige morfologier, hver dannet 3D strukturer i 1536-godt assay plader. Figur 2</stro…

Discussion

De metoder, der præsenteres her dokumentere en detaljeret protokol om, hvordan man producerer tumor spheroids i 1536-godt plader for store sammensatte screeninger. Disse metoder var oprindeligt tilpasset fra arbejde på National Cancer Institute hvor tumor spheroids blev dyrket i lav-overførselshastighed assays i 6-godt og 96-brønd plader til at stille spørgsmål om genetiske afhængigheder og sammensatte følsomhed^{13, 14 , 15</su…}

Materials

Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek