創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成
Summary
さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース システムで上映することができますどのように立体化腫瘍を示しています。
Abstract
プラスチックの表面を 2 次元 (2 D) 中がん細胞で培養されたが日常的に。この手法は、しかし、欠けている腫瘍の真の環境質量は、 in vivoにさらされています。固形腫瘍はプラスチック、関連付けられているシートではなく育つが、三次元 (3 D) のクローン細胞のコレクションとして代わりにスペースの彼らの隣人と正常細胞の極性の中断などの空間特性の相互作用します。これらの相互作用を引き起こす 3 D 培養細胞の生体内で腫瘍により関連している形態学的および細胞の特性を獲得します。さらに、腫瘍間質と免疫細胞だけでなく、他のすべてのセル型から細胞外マトリックスなど他の細胞型との直接接触、質量。堆積したマトリックスは、コラーゲンとフィブロネクチンなどの高分子で構成されます。
ベンチから枕元に腫瘍学の研究成果の翻訳を向上しようとして、多くのグループは、医薬品開発戦略における 3 D モデル システムの使用を調査し始めています。これらのシステムは、彼らは腫瘍の複雑な異機種混在環境を再現しようと思うのでもっと生理学的に関連すると考えられます。これらのシステムはしかし、非常に複雑にすることができますが 96-ウェル フォーマットおよび 384 でも今いくつかの成長に従う、彼らは大規模な成長とスクリーニングのためのいくつかの選択肢を提供します。これは、観察のギャップは、1536 ウェル プレートの高スループット能力における文化腫瘍スフェロイドを詳しくここで説明する方法の開発につながっています。これらのメソッドは、画面、および従来の 2 D の試金することは困難である非常に複雑な行列ベース システムに妥協を表します。さまざまな遺伝的変異を異なるがん細胞は Mitogen-Activated 蛋白質キナーゼや MAPK 経路をターゲット化合物の精選されたライブラリを使用して化合物の有効性を調べること、正常に上映されます。スフェロイド培養反応を比較する、2次元の成長細胞の応答と差分の活動が報告されます。これらのメソッドは、高スループットの 3 D 設定の複合アクティビティをテストするための独自のプロトコルを提供します。
Introduction
過去 10 年間より多くの研究は、プラスチックで 2 D のセルの成長によって完全に締めくくっているない概念を理解する 3 D 細胞培養モデルの使用を実装しています。これらの概念の例としては、生存率と細胞の運命を制御する細胞外のマトリックスの役割と同様、細胞の樹状突起と基底層の空間的なオリエンテーションが失われ、正常な上皮細胞極性1交替。特に、腫瘍学研究は、がん細胞と 2 D と 3 D 細胞培養システム3,4の違いの基本的な生物学を理解するのに 3 D モデルを使用います。高度な細胞培養の技術とウェル フォーマットへ彼らのさらに適応の開発は、3 D 設定で新しい薬剤のための検索を可能にしました。階層型セルラー システム5から異なるサイズの単一細胞型球を複雑腫瘍範囲の 3 D モデル、2 D 条件の下で複雑なマルチ マルチセル型球6,7,細胞とは対照的8します。 新規化合物または強力これら 3 d モデル システムの細胞死を誘発する生物学的製剤の発見は、したがって、薬物開発キャンペーンで高金利。これらのアッセイのエンドポイントは通常は細胞増殖の変化を評価するために 2D 文化で実行されるものと同じ、彼らはターゲット遺伝子や経路中の依存性の本当のレベルを明らかにするかもしれないときにもっと生理学的に関連する設定で実施し、尋問。
3次元培養系における薬物応答を検討するさまざまなモデル システムを開発されていると上記で紹介したが、大半どちらか 96 または 384 ウェルのマイクロ プレートを使用でよく使われる高スループットス クリーニング (HTS) 形式に容易に適応しません。薬物探索スクリーニング キャンペーン。このようなシステムは、液滴技術、回転楕円体の文化、天然または合成ゲル コラーゲン、マトリゲル、ポリエチレング リコール (PEG)2 などを組み込んだ浮上、文化を誘発する磁性粒子と細胞を脈動をぶら下げの使用を含む.1536 ウェル プレート形式で確立された細胞株から 3 D 回転楕円体文化を生成する手法の開発済みの詳細な方法を紹介します。このプロトコルでは、通常付着性のセル行9の添付ファイルを防止する非常に定義された媒体が使用されます。このシステムの制限があります (すなわちがんの複雑なモデル システムに完全に要約するだろうことはできません)、それにもかかわらず、これらの試金は低分子化合物の大規模なコレクションおよび薬剤応答の横比較のハイスループットス クリーニングを有効にします。間細胞および化合物のさまざまな 2D および 3D の文化。
細胞株は MAPK シグナル伝達経路は非常に癌の調節不全を経路に関係する遺伝子の突然変異港すべてこの資料の方法を示すが選択し、多くの治療法があります。路線の多くがあるもと呼ばれ、KRA、神経芽細胞腫 RAS または nras 登録で、ハーヴェイ ラット肉腫ウイルスの癌遺伝子または HRA、関連するキナーゼ、急速に加速する Fibrosarcomas として知られているキルステン ラット肉腫ウイルス発癌性突然変異をアクティブにします。Raf。最近の文献では、この経路の異なるノードの阻害剤は、3 D の条件9,10の下で育てられたときの細胞のサブセットの一意により効果があることを示唆しています。1 つの研究が見つかりました 3 D でアクティブな RAS 癌細胞培養、それら MAPK の阻害剤への感受性の増加を示したし、さらに、このアプローチは経路を識別することができるし、伝統的な 2 D で逃したかもしれない阻害剤を対象と設定します。本研究の目的はこれらの細胞株を培養するために使用方法を提示する、さらに、差分を示す 3 D を使用して場合にのみに観察することができますこれらの阻害剤への応答細胞培養システム。
Protocol
Representative Results
Discussion
紹介した方法は、大規模化合物スクリーニングのための 1536 ウェル プレートで腫瘍を回転楕円体を生成する方法の詳細なプロトコルを示します。これらのメソッドは当初腫瘍回転楕円体が遺伝的依存関係および化合物の感度13,について質問をする 6 ウェルや 96 ウェルのプレートの低スループット試金で育った国立がん研究所での仕事から合わせられました。<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼のサポートとこれらのアッセイの初期の開発に関するガイダンスを進めるトランスレーショナル科学、健康の国民の協会の国立センターでマルク ・ フェレールを認めると思います。さらに、彼らの科学知識とプロジェクト チームのメンバーとの議論のためアリソン ・ フリーマン、マリエラ Jaskelioff、マイケル ・ アッカー、ヤコブ Haling、Vesselina ・ クックに感謝したいと思います。
Materials
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
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