Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues
Summary
Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.
Abstract
Les cellules cancéreuses ont systématiquement été cultivés en deux dimensions (2D) sur une surface en plastique. Cette technique, cependant, n’a pas le vrai environnement une tumeur masse affleure à in vivo. Tumeurs solides poussent non pas comme une feuille jointe au plastique, mais plutôt comme un ensemble de cellules clonales dans un en trois dimensions (3D) espace interagissant avec leurs voisins et avec des propriétés spatiales distinctes telles que l’interruption de la polarité cellulaire normale. Ces interactions provoquent des cellules cultivées en 3D à acquérir des caractéristiques morphologiques et cellulaires qui sont plus pertinentes pour les tumeurs in vivo . En outre, une tumeur masse est en contact direct avec les autres types de cellules comme les cellules stromales et immunitaires, ainsi que la matrice extracellulaire de tous les autres types de cellules. La matrice déposée est constituée de macromolécules biologiques, comme le collagène et la fibronectine.
Dans le but d’augmenter la traduction des résultats de la recherche en cancérologie de banc au chevet du patient, de nombreux groupes ont commencé à enquêter sur l’utilisation de systèmes de modèles 3D dans leurs stratégies de développement de médicaments. Ces systèmes sont censés être plus physiologiquement pertinentes car elles tentent de récapituler l’environnement complexe et hétérogène d’une tumeur. Ces systèmes, cependant, peuvent être assez complexes, et, bien que favorable à la croissance de formats de 96 puits et d’autres maintenant même en 384, ils offrent peu de choix pour la croissance à grande échelle et de dépistage. Cette observée écart a conduit à l’élaboration des méthodes décrites ici en détail de sphéroïdes de tumeur de la culture dans une capacité de haut débit en plaques 1536 puits. Ces méthodes représentent un compromis aux systèmes de matrice-basé très complexes, difficiles à l’écran et des essais 2D classiques. Une variété de lignées de cellules cancéreuses hébergeant des mutations génétiques différentes sont retenus et menée, en examinant l’efficacité composée en utilisant une bibliothèque organisée des composés ciblant la voie Mitogen-Activated protéine Kinase ou MAPK. Les réponses de culture sphéroïde sont ensuite comparées à la réponse des cellules cultivées en 2D, et activités différentielles sont signalées. Ces méthodes fournissent un protocole unique pour tester l’activité composée dans un cadre 3D haut débit.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, de plus en plus des études ont mis en place l’utilisation de modèles de culture de cellules 3D de comprendre les concepts qui ne sont pas entièrement récapitulées en cultivant des cellules en 2D sur plastique. Exemples de ces concepts incluent les alternances dans les cellules épithéliales normales polarité1 où l’orientation spatiale de couches basales et apicales des cellules sont perdus, ainsi que le rôle de la matrice extracellulaire dans la régulation de la survie et le sort de la cellule. Recherche en oncologie, en particulier, utilise des modèles 3D pour comprendre la biologie fondamentale des cellules cancéreuses et les différences entre 2D et 3D cell culture systèmes3,4. Le développement des techniques de culture cellulaire plus sophistiqués et leur adaptation supplémentaire aux formats multipuits a permis à la recherche de nouveaux médicaments dans paramètres 3D. Contrairement aux cellules cultivées dans des conditions 2D, des modèles 3D de la gamme de tumeurs dans la complexité de systèmes cellulaires en couches5 de type single-cell sphères de différentes tailles, complexe multi-cell-type sphères6,7, 8. la découverte de nouveaux composés ou un agent biologique qui puissamment induire la mort cellulaire dans ces systèmes de modèle 3D est, par conséquent, d’un grand intérêt dans les campagnes de développement de médicaments. Points de terminaison de ces tests sont souvent identiques à celles exercées dans les cultures 2D pour évaluer les changements dans la prolifération cellulaire, mais lorsque menées dans un cadre plus physiologiquement pertinent, ils peuvent révéler le véritable niveau de dépendance du gène cible ou en voie interrogé.
Tel que présenté ci-dessus, une variété de systèmes modèles ont été développés pour étudier les réponses de drogue dans des systèmes de culture 3D, mais la plupart utilise deux microplaques 96 ou 384 puits et n’est pas facilement adaptable aux formats haut débit (HTS) de dépistage souvent utilisés dans les campagnes de dépistage de découverte de médicaments. Ces systèmes comprennent l’utilisation d’accrocher technologies gouttelette, cultures de sphéroïde, pulsant de cellules avec des particules magnétiques pour induire la lévitation et les cultures, incorporant des gels naturels ou synthétiques comme le collagène, Matrigel ou polyéthylène glycol (PEG)2 . Nous présentons ici les méthodes détaillées d’une technique déjà développée pour produire des cultures de sphéroïde 3D provenant de lignées cellulaires établies du cancer dans un format de plaque 1536 puits. Dans le présent protocole, un milieu très défini est utilisé qui empêche la fixation des lignées de cellules adhérentes normalement9. Ce système a des limites (par exemple, il ne peut pas récapituler complètement un système complexe modèle de cancer), mais néanmoins, ces tests permettent un criblage à haut débit de grandes collections de petites molécules et des comparaisons en travers de la réaction aux médicaments entre 2D et 3D des cultures contre une variété de lignées cellulaires et composés.
Les lignées de cellules sélectionnées afin de démontrer les méthodes dans cet article toutes les mutations dans les gènes associés à la signalisation de voie, une voie qui est hautement dysrégulation dans le cancer, MAPK harbor et pour les thérapies dont beaucoup sont disponibles. Beaucoup de lignes ont activation d’oncogènes mutations du virus Kirsten Rat Sarcoma, également dénommé KRAS, le RAS de neuroblastome ou ARN, l’oncogène virus de sarcome de Rat Harvey ou HRAS et les kinases associées rapidement accéléré fibrosarcomes, également connu sous le nom Fra. La littérature récente suggère que les inhibiteurs des différents nœuds de cette voie sont particulièrement bien plus efficaces pour un sous-ensemble des lignées cellulaires lorsqu’il est cultivé sous des conditions 3D9,10. Une étude a révélé que lorsque les cellules cancéreuses avec RAS active ont été cultivées en 3D, ils ont démontré une sensibilité accrue aux inhibiteurs de la MAPK et en outre, que cette approche pourrait identifier les voies et ciblé des inhibiteurs qui pourraient manquer dans le 2D traditionnelle réglage. L’objectif de cette étude est de présenter les méthodes utilisées pour la culture de ces lignées cellulaires, et plus, pour démontrer la différence de réponses à ces inhibiteurs que l’on peut observer seulement en utilisant 3D cell systèmes de culture.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes présentées ici montrent un protocole détaillé sur la façon de produire des sphéroïdes de tumeur en plaques 1536 puits pour projections composées à grande échelle. Ces méthodes ont été initialement adaptés au travail à l’Institut National du Cancer où sphéroïdes de tumeur ont été cultivées dans des essais de faible débit dans des plaques 6 puits et 96 puits à poser des questions sur la génétiques dépendances et sensibilité composé13, <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait Marc Ferrer au Centre National pour faire progresser les Sciences translationnelle, National Institutes of Health pour son soutien et ses conseils sur le développement initial de ces tests. En outre, nous tenons à remercier Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling et Vesselina Cooke pour leur apport scientifique et de la discussion que les membres de l’équipe du projet.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer–cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
