在这里, 我们提出一个协议, 以消融基因标记亚群的神经元由双光子激光从斑马鱼幼虫。
为了确定神经元的亚群在行为中的作用, 必须测试阻断其在活动物中活动的后果。当神经元选择性地用荧光探针标记时, 激光消融神经元是一种有效的方法。在本研究中, 介绍了用双光子显微镜对神经元进行亚群的激光烧蚀及其功能和行为后果的测试。本研究采用斑马鱼幼虫捕食行为作为研究对象。pretecto-下丘脑电路是已知的基础上这种视觉驱动的猎物捕捉行为。斑马鱼 pretectum 激光消融, 下丘脑下叶 (ILH; pretectal 投射的目标) 进行了神经活性检查。pretectal 消融后的猎物捕获行为也进行了测试。
为了理解大脑中神经元活动的行为是如何产生的, 有必要识别出这种行为产生的神经回路。在幼虫阶段, 斑马鱼提供了一个理想的动物模型来研究与行为相关的大脑功能, 因为它们的小而透明的大脑使人们有可能在一个广泛的区域内研究细胞分辨率的神经元活动。大脑, 同时观察行为1。通过基因编码钙 (Ca) 指标 (GECIs) (如 GCaMP2) 的发明, 可以使特定神经元的神经元活动成像成为可能。GCaMP 转基因斑马鱼已证明是有用的关联功能性神经回路与行为通过进行 Ca 成像在行为动物3。
虽然 Ca 成像可以证明神经元活动和行为之间的相关性, 显示因果关系, 抑制神经元活动和测试其后果的行为是重要的步骤。有多种方法可以实现这一点: 利用基因突变改变特定的神经回路4, 在特定神经元5,6中表达毒素, 使用 optogenetic 工具 (如 halorhodopsin7) 和靶向神经元的激光消融8,9。激光消融特别适合于在相对少量的特定神经元中消除活性。通过杀死神经元不可逆转地消除神经元活动有助于评估行为后果。
在斑马鱼幼虫阶段可以观察到的一个有趣的行为是猎物捕获 (图 1A)。这种视觉引导, 目标导向的行为提供了一个良好的实验系统的视觉敏锐度的研究10, visuomotor 转换11,12,13, 视觉感知和识别对象14,15,16,17,18, 决策19。在神经行为学20 中, 捕食者如何识别猎物以及猎物检测如何导致猎物捕获行为一直是一个中心问题。在本文中, 我们关注的作用, 形成的 pretecto-下丘脑的 pretectum (核 pretectalis superficialis, 此后, 简单地指出 magnocellularis) 的核投射到 pretectum。激光消融的 pretectum 被证明可以减少猎物捕获活动, 并废除与视觉猎物知觉21相关的 ILH 中的神经元活动。这里介绍了使用 Ca2 +成像和行为记录在斑马鱼幼虫中进行激光消融和测试效果的协议。
虽然双光子激光器有一个很好的空间分辨率来专门消融单个神经元, 但应谨慎地避免因热而对脑组织造成任何不应有的损伤。在烧蚀实验中, 最重要的一步是确定激光辐照的最佳量。辐射不足无法杀死神经元。太多的辐照会对周围的组织造成热损伤, 这将导致不想要的效果。激光辐照的最佳范围 (ROIs 区域、迭代次数和扫描速度) 似乎很窄。影响消融效率的因素有几个。
首先, 使…
The authors have nothing to disclose.
这些研究由下个、jsp KAKENHI 赠款编号 JP25290009、JP25650120、JP17K07494 和 JP17H05984 提供的赠款资助。
NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
SZX7 | Olympus | stereoscope | |
DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |