두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거
Summary
여기, 우리는 프로토콜 Zebrafish 애벌레에서 2 광자 레이저로 뉴런의 유전자 표시 부분 모집단을 ablate을 제시.
Abstract
동작에서 뉴런의 부분 모집단의 역할을 확인 하려면 차단 하는 살아있는 동물에 그것의 활동의 결과 테스트 필수적 이다. 레이저 절제 뉴런의 신경 세포는 선택적으로 형광 프로브로 표시 된 경우이 목적을 위해 효과적인 방법입니다. 현재 연구에서 레이저 ablating 신경 2 광자 현미경을 사용 하 고 그 기능 및 행동 결과의 테스트의 부분 모집단에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 연구에서 zebrafish 애벌레에 먹이 캡처 동작 연구 모델로 사용 됩니다. 이 시각 기반 먹이 잡는 동작을 기초 pretecto hypothalamic 회로 알려져 있다. 제 브라 pretectum 레이저 녹지, 그리고 열 등 한 엽 (ILH; pretectal 투영의 대상) 시상 하 부의 신경 활동 조사 되었다. Pretectal 제거 후 먹이 캡처 동작 또한 시험 되었다.
Introduction
동작 뇌의 신경 활동에서 발생 하는 방법을 이해 하는 그 행동의 생성에 관여 하는 신경 회로 식별할 필요가 있다. 애벌레 단계에서 zebrafish는 그들의 작은, 투명 한 두뇌는 신경 활동의 광범위 한 영역에서 셀룰러 해상도에서 조사를 가능 하 게 하기 때문에 동작와 관련 된 두뇌 기능을 공부에 대 한 이상적인 동물 모델을 제공 합니다 1동작 관찰 하는 동안 두뇌입니다. 특정 뉴런에 신경 활동의 이미징 유전자 인코딩된 칼슘 (Ca) 지표 (GECIs) GCaMP2등의 발명을 통해 가능한 되고있다. 제 브라 GCaMP 유전자 변형 동물3행동에서 Ca 이미징 실시 하 여 동작 기능 신경 회로 연결 하는 데 유용 하 게 입증 했습니다.
Ca 이미징 신경 활동과 행동 사이의 상관 관계를 설명할 수 있다, 그러나 인과 관계, 보여 신경 활동과 행동에 그것의 consequence(s)를 테스트의 중요 한 단계가 있습니다. 이를 위해 다양 한 방법이 있다: 특정 신경 회로4, 특정 뉴런5,6, halorhodopsin7, optogenetic 도구를 사용 하 여 신경의 표현 변경 유전자 변이의 사용 및 레이저 타겟된 신경8,9의 제거. 레이저 절제술은 상대적으로 적은 수의 특정 뉴런에 활동을 제거에 대 한 특히 적합 합니다. 신경 세포를 죽 여 신경 활동의 돌이킬 수 없는 제거 행동 결과 평가 촉진 한다.
Zebrafish의 애벌레 단계에서 관찰 될 수 있는 하나의 재미 있는 행동은 먹이 캡처 (그림 1A). 시력10, visuomotor 변환11,,1213, 시각 지 각의 인식의 연구에 대 한 유리한 실험 시스템을 제공 하는이 시각 가이드, 목표 지시 동작 개체14,15,,1617,18, 그리고 의사 결정19. 어떻게 먹이 neuroethology20에서 중앙 질문 되었습니다 잡는 행동 포식 자와 먹이 탐지 먹이를 리드 하는 방법에 의해 인식 된다. 이 문서에서 우리는 pretectum에서 핵의 계획에 의해 형성 된 pretecto hypothalamic 회로의 역할에 초점 (핵 pretectalis superficialis 갈 거 예요 magnocellularis,이 하, 간단 하 게는 pretectum으로 표시)에 ILH 하. pretectum의 레이저 절제 먹이 캡처 활동을 줄이고 ILH 시각적 먹이 지 각21와 관련 된 신경 활동 폐지를 표시 했다. 여기, 수행을 위한 프로토콜 레이저 절제 및 애벌레 설명 zebrafish의 캘리포니아2 + 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 그것의 효과 테스트.
Protocol
Representative Results
Discussion
두 광자 레이저는 구체적으로 개별 뉴런을 ablate을 우수한 공간 해상도, 위대한 주의 뇌 조직의 열 때문에 원치 않는 어떤 손상을 피하기 위하여 취해야 한다. 제거 실험에서 가장 중요 한 단계는 최적의 레이저 방사선 양을 결정 하는. 부족 한 방사선을 신경 세포를 죽 일 실패 합니다. 너무 많은 방사선 열 손상 주변 조직, 바람직하지 않은 효과가 발생할 것입니다 것입니다. 레이저 조사 (ROIs, 반복…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 연구는 문 부 과학성, JSP KAKENHI 보조금 번호 JP25290009, JP25650120, JP17K07494, 및 JP17H05984에서 받은 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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