Summary
Her presenterer vi en protokoll for å ablate en genetisk merket subpopulasjon av neurons av en to-fotonet laser fra sebrafisk larver.
Abstract
For å identifisere rollen som en subpopulasjon av nerveceller i oppførsel, er det viktig å teste konsekvensene av blokkere sin aktivitet i levende dyr. Laser ablasjon neurons er en effektiv metode for dette formålet når neurons er selektivt merket med fluorescerende sonder. Studien, er protokoller for laser ablating en subpopulasjon av neurons bruker to-fotonet mikroskop og testing av funksjonelle og atferdsmessige konsekvensene beskrevet. I denne studien brukes byttedyr fange atferd i sebrafisk larver som studien modell. Pretecto-hypothalamus krets kjent ligger denne visuelt-drevet byttedyr fanger atferd. Sebrafisk Pretetto var laser-ablated, og nevrale aktivitet i dårligere flik av hypothalamus (ILH, målet for pretectal projeksjon) ble undersøkt. Byttedyr fange virkemåte etter pretectal ablasjon ble også testet.
Introduction
For å forstå hvordan problemet oppstår fra nevrale aktivitet i hjernen, er det nødvendig å identifisere nevrale kretser som er involvert i generasjon adferden. På larvestadiet, sebrafisk gir en ideell dyremodell for studere hjernefunksjon knyttet virkemåten fordi liten, gjennomsiktig hjernen gjør det mulig å undersøke neuronal aktivitet mobilnettet oppløsning i bredt område av den hjernen mens observere atferd1. Bildebehandling neuronal aktivitet i bestemte neurons har blitt mulig gjennom oppfinnelsen av genetisk kodet kalsium (Ca) indikatorer (GECIs) som GCaMP2. GCaMP transgene sebrafisk har vist seg for å være nyttig for å knytte funksjonelle nevrale krets med atferd ved å gjennomføre Ca imaging i oppføre dyr3.
Mens Ca bildebehandling kan vise sammenhenger mellom neuronal aktivitet og atferd, for å vise kausalitet, undertrykkelse av neuronal aktivitet og teste sin consequence(s) oppførsel er viktige skritt. Det finnes ulike måter å oppnå dette: bruk av genetisk mutasjon som endrer bestemte nevrale kretser4, uttrykk for nervegifter i bestemte neurons5,6, bruk av optogenetic verktøy som halorhodopsin7, og laser ablasjon målrettet neurons8,9. Laser ablasjon er spesielt egnet for å fjerne aktiviteten i et relativt lite antall bestemte neurons. Uhelbredelig eliminering av neuronal aktivitet ved å drepe neurons forenkler vurdere atferdsmessige konsekvenser.
En interessant atferd som kan observeres på larvestadiet i sebrafisk er byttedyr fange (figur 1A). Dette visuelt-guidede, målrettet gir en gunstig eksperimentelle system for studier av synsskarphet10, visuomotor transformasjon11,12,13, visuell persepsjon og anerkjennelse av objekter,14,,15,,16,,17,,18, og beslutningsprosesser19. Hvordan bytte er anerkjent av rovdyr og hvordan byttedyr oppdagelsen fører til byttedyr fanger oppførsel har vært et sentralt spørsmål i neuroethology20. I dette papiret, vi fokusere på rollen pretecto-hypothalamus krets dannet av projeksjoner av en kjerne i Pretetto (kjernen pretectalis superficialis pars magnocellularis, heretter, bare kjent som Pretetto) å ILH. Laser-ablasjon av Pretetto ble vist å redusere byttedyr fange aktivitet og avskaffe neuronal aktivitet i ILH som er forbundet med den visuelle byttedyr oppfatning21. Her, laser protokoller for å utføre ablasjon og teste dens effekt ved hjelp av Ca2 + imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk Larvene er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ablasjon av en subpopulasjon av Neurons bruker en to-fotonet Laser mikroskopet
Merk: Hvis brukere planlegger å utføre Ca tenkelig følgende ablasjon, bruke UAShspzGCaMP6s linje21. Hvis brukere planlegger utfører atferdsmessige opptak etter ablasjon, bruk UAS:EGFP linjen, ablation EGFP-positive celler er enklere å utføre enn GCaMP6s-uttrykke celler.
- Begynn med å sette opp mating Gal4 linjen som merker bestemt neurons studier og UAS:EGFP eller UAShspzGCaMP6s. Husk å bruke nacre bakgrunnen for begge foreldrene slik at nacre homozygotes kan skaffes.
Merk: Homozygotes av nacre inneholder ingen melanophores på kroppen overflaten (figur 1B). I dag studere, en Gal4 linje gSAIzGFFM119B (hvilke merker Pretetto) og en annen Gal4 linje hspGFFDMC76A (hvilke merker ILH) brukte21. - På dagen for parring samle sebrafisk egg og heve dem til larvestadiet da neurons rundt vil uttrykke fluorescerende journalister.
- Montere sebrafisk Larven i 2% lavt Smeltepunkt-agarose (figur 1B).
- Begynn med å forberede 2% agarose lager løsning: oppløse 2 g lavt Smeltepunkt agarose pulver i 100 mL system vann (dvs., vann brukt å opprettholde voksen sebrafisk i en sirkulerende vann system)22 eller E3 vann23, ved å bringe vannet Kokepunkt i mikrobølgeovn og blande kraftig.
- Mikrobølgeovn 2% lavt Smeltepunkt agarose aksjen til det koker. Hell 3.5-4.0 mL agarose på lokket på en 6 cm Petriskål. Vent til agarose kjøler slik at det er varmt å ta før du fortsetter.
- Deretter Plasser en enkelt Larven (ikke anesthetized på dette trinnet) i agarose. Holde justerer posisjonen og orientering av Larven slik at det er oppreist, bruker en dissecting nål (figur 1C), til agarose stivner for å sikre riktig plassering av Larven.
Merk: Larven vil fortsette å svømme rundt mens agarose stivner. - Når Larven er plassert, Tillat 5 min for agarose å størkne helt.
- Hell 5 mL tricaine løsning (0,4% 1 x arbeider konsentrasjon) over på agarose.
Merk: For å unngå bevegelser larver under laser ablasjon, må Larvene holdes bedøvet gjennom ablasjon prosedyre.
- Ablate Larven funksjonen bleking i en to-fotonet laser mikroskopi system.
- Plasser agarose-innebygd Larven under en to-fotonet laserskanning mikroskop og starte mikroskopi systemet.
- Start bilde oppkjøpet programmet og velg knappen "På" kategorien "Laser" aktivere laser (figur 1D). Vente på "Status" av laser endre fra "Opptatt" til "Modus-låst."
- Kategorien "Kanaler" satt av laser bølgelengde på 880 nm (maksimal: ca 2300 mW) for EGFP ablasjon eller på 800 nm (maksimal: cirka 2600 mW) for GCaMP ablasjon.
- Velg den 20 X linsen ved å manuelt flytte linsen revolver. Velg kategorien "Finn", klikk "GFP" endre optisk veier, og direkte vise fluorescensen av øyet.
- Finn sebrafisk larver hjernen i midten av visningen. Klikk kategorien "Erverv" gå tilbake til to-fotonet mikroskopi.
- Som en av betingelsen 'før ablasjon", ta en z-stack bilde med til 20 X linsen på rask skanning-hastighet (for å unngå varme-skade). Senere sammenligne bildene tatt før og etter ablasjon eksperimenter (figur 2A). Klikk "Z-Stack" for å velge alternativet z stabel og utvide kategorien angir nedre grense (klikk "Sette første" knappen") etter fokusering på ventral slutten av larver hjernen, og angi øvre grense (klikk"Sette siste"knapp) for å få en z-stabel, etter fokusere på den dorsal mest-overflaten av hjernen. Klikk knappen "Start eksperiment" å kjøre bildeopptak z stabel.
- Velg de 63 X linsen ved å manuelt flytte linsen revolver.
- Velg kategorien "Søk" for å bytte til epi-fluorescerende mikroskopi, finne cellene å bli ablated i sentrum av visning av øyet, og klikk kategorien "Erverv" gå tilbake til laser skanning mikroskopi.
- Kategorien "Oppkjøpet Mode" satt "Rammestørrelsen" på 256 x 256. Klikk "Live" og observere neurons rundt.
- Fra siden dorsal mest, finne en fokalplanet der cellene å være ablated er i fokus.
- Merke en liten, rundskriv området om lag en tredel cellens størrelse i diameter på hver Nevron som en region av interesse (ROI) ved hjelp av funksjonen "Områder".
- Angi skannehastighet til 13.93 s/256 x 256 piksler (134.42 µm x 134.42 µm), som tilsvarer en laser bor tid ca 200 µs/bildepunkt eller 200 µs/0,5 μm. Også sette 4 gjentakelser (' gjentakelse syklus: 4'). Alternativt, optimalisere antall gjentakelser og skanning fart slik at tilstrekkelig ablasjon oppnås.
- Utføre funksjonen "Bleking" for ablasjon, sammen med 'tidsserien (2 sykluser)' for å image sample (før og etter ablasjon) og "Områder" (for å angi ROIs) eller tilsvarende funksjoner i programvaren som brukes (figur 1D).
- Ved å sammenligne det første bildet (før ablasjon) og det andre bildet (etter ablasjon) i tidsserien syklus, sikre det etter bleking, fluorescens i målrettede celler synker som observert på bakgrunnen nivå (figur 2B).
- Hvis fluorescens er fremdeles etter ablasjon, øke antall gjentakelser.
- Deretter flytter fokalplanet litt dypere (dvs., mot ventrale), og velg neste fokalplanet hvor un ablated celler vises.
- Utføre funksjonen bleking som beskrevet ovenfor (trinn 1,9). Gjenta disse trinnene til alle celler i neural strukturen av interesse har vært ablated.
- Etter å gå gjennom alle fokal flyene dekker de nevrale strukturene for å være ablated, sjekk celler for avskaffet fluorescens. Hvis noen celler finnes fortsatt være lysrør på grunn av utilstrekkelig ablasjon, laser-irradiate dem igjen som beskrevet ovenfor.
- Hvis Larven må gjenopprettes fra agarose etter laser irradiation, ikke prøv å tvinge det av agarose fordi dette kan skade Larven. I stedet gjør forsiktig små kutt i agarose rundt Larven vinkelrett på overflaten av kroppen. Deretter vente Larven å svømme av agarose på egen hånd når anesthetic slites av.
- Fortsett til neste Larven for ablasjon eller utføre kontroll eksperimenter ved hjelp av en annen befolkningen av neurons som uninvolved i oppførsel under etterforskning.
Merk: Her, som en kontroll, olfactory pære nerveceller i UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larver var laser-ablated bruke samme protokoll beskrevet ovenfor (figur 2A, høyre). - Tillate flere timer eller 1 dag for utvinning før du fortsetter til Ca imaging (del 2) eller atferdsmessige opptak (del 3). Samtidig utvinning kontroller larver helse (dvs., normal spontan svømming, ingen åpenbare varmeskade rundt ablated område, etc.) og fjern Larvene viser alle underskriver av dårlig helse.
2. kalsium Imaging å registrere Prey-utløste Neuronal aktivitet i Pretetto-ablated sebrafisk Larvene
- Forberede en innspilling kammer, sette en sikker-forsegling hybridisering kammer pakning på et glass lysbilde, med den selvklebende siden vendt på glasset og fjern topp forseglingen.
Merk: Dette skaper en liten opptak kammer som er 9 mm i diameter og 0,8 mm i dybde (Figur 3A). - Deretter plasserer en nylon maske (størrelsen på åpningen: 32 µm) på en 50-mL tube med bunnen klippes. Bruk cap for å koble mesh på røret (Figur 3B).
- Forberede paramecia (som er byttet til brukes som visuell stimulans for Larven).
Merk: Forberede Paramecium kultur (trinn 2.3.1 og 2.3.2) på forhånd.- Få paramecia frø kultur fra kommersielle kilder eller akademiske bio-ressurs sentre24 på forhånd.
- Kultur paramecium i flere dager i vann som inneholder autoklaveres ris strå og pellets øl-tørrgjær22 (Figur 3C).
- Hell paramecium kultur gjennom 2 sikter suksessivt (med en 150-µm blenderåpning, etterfulgt av en annen med en 75-µm blenderåpning) å fjerne rusk fra kulturen.
- Samle inn paramecia i gjennomflytsenhet fra forrige trinn på en nylon maske (13-µm blenderåpning).
- Nytt suspendere paramecia på nylon mesh i et glass beaker med en klem flaske system vann (Figur 3D).
- Skyll mesh (Figur 3B) i system vann 2 x (Figur 3E).
Merk: Formålet med dette trinnet er å fjerne alle mulig odorants og tastants i paramecium kultur mediet, målet med denne studien er å observere visuelt drevet neuronal aktivitet. - Sted en sebrafisk larve i tricaine løsningen å bedøve.
- Montere en enkelt larve i 2% lavt Smeltepunkt agarose.
- Først mikrobølgeovn 2% lavt Smeltepunkt agarose og Legg til 1/10 volumet av 10 x konsentrert tricaine agarose.
- Plass en dråpe tricaine inneholder agarose på opptak kammeret (Figur 3A).
- Etter å ha bekreftet agarose er ikke for varmt, plassere bedøvet Larven (fra trinn 2.5) i agarose, umiddelbart fjerne alle overflødig agarose slik at overflaten av agarose ser litt konveks.
- Raskt orientere Larven i oppreist stilling med en dissecting nål (figur 1C).
Merk: Disse prosedyrene må fullføres innen flere sekunder før agarose stivner. - Når Larven er riktig plassert, Tillat 5 min for agarose å størkne helt. Så, hell en dråpe 1 x tricaine løsning på agarose.
- Fjerne agarose rundt hodet av sebrafisk Larven og gjøre plass til paramecium å svømme med en kirurgisk kniv. Gjør først gjøre noen små kutt i agarose (Figur 3F). Deretter forsiktig fjerne overflødig agarose ved å forsiktig helle system vann på kammeret.
Merk: I dette trinnet vil i tricaine bli vasket ut. - Neste, putte en paramecium i innspillingen kammer å tjene som en visuell stimulans.
Merk: Når paramecium svømmer nær hodet av sebrafisk Larven, vil det vekke neuronal svar (Figur 3G). - Sted opptak kammeret under en epi-fluorescens mikroskop utstyrt med en vitenskapelig CMOS-kamera (Figur 3H) og velg en 2,5 X linsen (Figur 3jeg).
- Samle time-lapse opptak GCaMP fluorescens signaler.
- Start bilde oppkjøpet programmet for utstyrt kameraet.
- Klikk "Sekvens Pane" og velg "Harddisken Record" i ruten. Angi den "ramme Count" til 900 eller noen andre totale bildenummer ønsket i delen innstillinger for skanning.
Merk: Hvis tilgjengelig, bruke tid-lapse innspillingen programvare med en modul (her "harddisken posten") som muliggjør effektiv lagring av data på en harddisk. - I ruten "Fange" Angi eksponeringstid på 30-ms (dvs., 33.3 fps), og Binning 2 x 2.
- På mikroskopet kontrollere berøringspanel, velger du et filter angitt for GFP, som GCaMP har lignende eksitasjon/utslipp spectra til GFP.
- Klikk "Live" på ruten fange å finne Larven i kameravisning og fokus (Figur 4A), og klikk "Stopp Live" og klikk "Start"-knappen. Lagre filmen i .cxd eller andre formater som inneholder informasjon om betingelsen oppkjøpet.
- Etter innspillingene, analysere GCaMP6s fluorescerende signaler (Ca signaler) ved å få mener bildepunktverdier for Avkastningen på en hjernens struktur i time-lapse filmen bruker gratisprogrammet Fiji25.
Merk: Fiji er en versjon av ImageJ med mange nyttig plugg-inne er forhåndsinstallert og kan lese .cxd format bildefiler med Bio-formatene plug-in. - Hvis Larven flytter litt under innspillingen, utføre bilde registrering ved å kjøre TurboReg plug-in26 i Fiji. Menyen, velg "Plugins", 'Registrering' og 'TurboReg'.
- Vurdere hvordan å analysere dataene etter målet med undersøkelsen. Følgende er et eksempel.
- Beregne F/F0 (fluorescens intensitet på hver gang delt fluorescens intensiteten på resten eller før noen Ca forbigående oppstod) som følger:
- Angi ROIs på Pretetto eller ILH bruker avkastning Manager: menyen, velg "Analysere" "Verktøy", "ROI Manager", og "Legg til" i listen over ROIs (Figur 4A).
- Beregne mener pikselverdiene for ROIs (dvs., fluorescens intensiteter av GCaMP6s) ved å velge i Avkastningen Manager-panelet: "Mer," "Flere tiltak" og "OK". Lagre resultatene som en regnearkfil.
- Signalene er støyende, gjennomsnittlig signalene for 11-tidspunkt (glidende gjennomsnitt) bruker et program som kan håndtere regnearkdataene.
- Dele F (fluorescens intensiteter over tid) F0 (fluorescens intensitet på basale nivå) til å beregne normalisert fluorescens intensiteten. Et eksempel på datavisualisering, endringer i normalisert GCaMP6s fluorescens intensiteten i Pretetto og ILH er fargekodet og tilordnet på paramecium baner (Figur 4B - D).
3. vurdering av atferdsmessige konsekvenser etter Laser ablasjon
- Definere en opptreden innspillingssystem som består av en stereoscope utstyrt med et videokamera. Bruke et kamera med en passende bilde oppkjøpet programvare, kommersielle eller skreddersydd (figur 5et).
- Optimalisere lysforhold slik at paramecium kan oppdages av bildebehandling. For eksempel bruke en ring hvite LED lys med et mellomrom (figur 5B).
Merk: Avstanden fra, vinkel, og LED påvirker utseendet til eksempelet (dvs., lys i mørke bakgrunnen eller mørk i lys bakgrunn) og er derfor avgjørende for vellykket bildebehandling. Bestemme beste høyden på avstand (figur 5C). - Plassere en sebrafisk Larven (gjenopprettet fra laser-ablasjon eksperimentet beskrevet i del 1) i en opptreden opptak kammer (som var festet til et glass lysbilde) med den opprinnelige topp seglet fjernet (figur 5D).
- Samle 50 paramecia fra kultur (trinn 2.3.5) bruker brønnene og plassere dem i innspillingen kammeret.
- Plass en cover slip over opptak kammeret. Legg en liten dråpe vann på cover slip å plassere på vannflaten av opptak kammer å unngå innføre luft i kammeret.
Merk: I dette trinnet vil noen vann med paramecia overflyt fra opptak kammeret. Gjenværende antall paramecia i innspillingen kammeret vil være ca 30-40. - Plass opptak kammeret (inneholder en larve og paramecia) i belysningssystemet (figur 5D).
- Start tid-lapse innspillingen på 10 fps i 11 minutter (6,600 bilder).
- (Valgfritt) For hver Larven som ble testet for oppførsel, observere fluorescens av laser-ablated områder av fluorescerende mikroskopi å bekrefte effektiviteten av den laser-ablation (dvs.fravær og reduserte antall, fluorescerende celler i laser-bestrålt området).
Merk: Selv etter bestråling, kan noen fluorescerende celler fortsatt observeres på grunn av senere utbruddet av Gal4 genuttrykk i celler som differensiert etter ablasjon27. - Etter innspillingen av Larvenes atferd, å kompensere for mangelen på ensartet i bakgrunnen, utføre en piksel for piksel avdeling av hver ramme med et gjennomsnittlig bilde i Fiji: Klikk 'Behandler', 'Bildet kalkulator', ' operasjon: dele ' "32- biters (flyt) resultat ', og ' OK'. Et gjennomsnittlig bilde klikk 'Bilde', "Stabler", "Z-Project", 'Gjennomsnittlig intensitet' og 'OK' (figur 5E, F).
- Teller antall paramecia igjen i kammeret ved å klikke "Analysere", "Analysere partikler", angi et område område som dekker alle de paramecia, sjekke avkrysningsruten «Vis: masker» og klikke "OK". Alternativet "Vis: masker" vil gi et utdraget paramecia bilde (figur 5G), med en liste over antall partikler (paramecia) i hver ramme.
- Tegne inn antall paramecia igjen i innspillingen kammeret over tid. Fordi anslag over antall paramecia er støyende, anbefaler vi utfører et glidende gjennomsnitt på hvert punkt i et utvalg av 600 rammens (1 min) i regnearket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemt neurons var genetisk benevnt med enten EGFP eller GCaMP6s, med uttrykk ble drevet i Gal4 linjer. En Gal4 linje gSAIzGFFM119B ble brukt til å merke en kjerne i pretectal området (magnocellular overfladisk pretectal kjernen), og en subpopulasjon av olfactory pære neurons. En annen Gal4 linje, hspGFFDMC76A, ble brukt til å merke ILH. Vi laser-ablated pretectal neurons bilateralt (figur 2A venstre panel) og også ablated nerveceller i olfactory pære bilateralt som en kontroll (figur 2A høyre panel) i sebrafisk larver av en Gal4 linje gSAIzGFFM119B som ble paret med UAS:EGFP reporter fisk. Resultatene viser at to-fotonet laser kan ablate målrettet celler mens tilstøtende celler eller neurites upåvirket (figur 2B).
Pretectal neurons prosjektet deres axons mot ILH ipsilaterally. Her undersøkt vi funksjonelle tilkoblingen med Ca imaging. Neuronal aktivitet i denne regionen kan observeres som Ca signaler med en Ca sonde GCaMP6s (Figur 4A), hvis uttrykket ble drevet av en Gal4 linje gSAIzGFFM119B (Figur 4B) eller en annen Gal4 linje hspGFFDMC76A (Figur 4 C). farget pilhodene (Figur 4) viser svømming retninger og baner av paramecium, samt fargekodede Ca signal-endringer i området angitt hjernen som ble vekket ved synet av svømming paramecium (Figur 4B-D). Både Pretetto (Figur 4B) og ILH (Figur 4C) viste neuronal aktiviteten i den proksimale tilstedeværelsen av byttedyr, tyder på at begge neuronal aktiviteter er visuelt drevet.
Ved hjelp av dobbel Gal4 GCaMP6s Larvene (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), vi ablated pretectal neurons ensidig og videre Ca imaging å observere neuronal aktivitet i Pretetto og ILH i ablated larver. Den venstre Pretetto som laser-ablated viste gjenværende ingen neuronal aktivitet (Figur 4D, øverst til venstre), tyder på at laser-ablasjon var vellykket. Men viste den ipsilateral ILH dramatisk redusert neuronal aktivitet (Figur 4D nederst til venstre), tyder på at den store bidrag til ILH kommer fra den ipsilateral Pretetto. I kontrast, ILH på den andre siden av laser-ablated Pretetto (Figur 4D nederst til høyre) viste neuronal aktivitet sammenlignes med neuronal aktiviteten i den ipsilateral Pretetto (Figur 4D, øverst til høyre), som antyder at den høyre ILH mottar inndata fra høyre Pretetto.
Valget av hvilke atferdsdata analyse bruke i et eksperiment er avhengig av det mulig roller av neurons under etterforskning. Her viser vi et eksempel på en byttedyr-fangst analysen etter ablasjon av en pretectal kjerne som ble identifisert som en byttedyr detektor21. Ved hjelp av belysningssystemet vist i figur 5A-D, kan antall paramecium i innspillingen kammeret telles av bildebehandling (figur 5E-G). Automatisert utvinning av øyne, og beregning av øyne posisjoner (dvs.endringer i vinklene av øynene) kan også være mulig fordi øynene til sebrafisk Larven se mørkere ut enn bakgrunnen i denne lysforhold (figur 5H ).
Resultatene av eksperimentet viser at bilaterale-ablasjon pretectum avskaffet byttedyr-fangst aktivitet (Fig. 5I, PT) mens ablasjon av en subpopulasjon av nerveceller i olfactory pæren ikke (figur 5jeg, OB). Disse resultatene, sammen med eksperimenter som vist i Figur 4, foreslår at pretecto-hypothalamus kretsen er avgjørende i bytte-fangst atferd.
Figur 1 . Sebrafisk larver. (A) fem - dagers gammel (5 dagers etter befruktning (5-dpf)) sebrafisk Larven og byttedyr, en paramecium. (B) 4-dpf nacre Larven innebygd i 2% lavt Smeltepunkt agarose. Merk at nacre belastningen mangler svart pigmenter på kroppen mens netthinnens pigment epitel er intakt. Skala bar: 0,5 mm. (C) Dissecting nål brukes til å orientere sebrafisk larver i agarose. Skala bar: 1 cm. (D) skjermbilde av programvaren brukes i to-fotonet mikroskopi, viser "Bleking", "Tid serien" og "Områder" paneler som ble brukt i ablasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Ablasjon av en subpopulasjon av neurons bruker to-fotonet laser mikroskop. (A) EGFP fluorescerende bilder av 4-dpf sebrafisk Larvene før og etter ablasjon neurons. Topp og sidevisning av 3D rekonstruert z-stakk bilder med bildebehandling. Z-stack bildene ble tatt med en 20 X linsen. De ablated områdene (enten Pretetto eller Luktelappen) er sirklet i gult. Skala bar: 100 µm. (B) eksempel på laser ablasjon på en enkelt fokalplanet funksjonen "Bleking". Laser-bestrålt områder (angitt som ROIs) vises i farger på hver celle. Skala bar: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Utarbeidelse av sebrafisk larver og paramecia for Ca bildebehandling. (A) opptak kammer. Kommersielt tilgjengelige 9 mm diameter x 0,8 mm dybde hybridisering pakning med 8 chambers ble benyttet som opptak kammeret. Pakningen ble satt på et glass lysbilde og overholdt. Forseglingen på pakningen ble skrellet av. (B) nylon mesh (32 µm) brukes til å rense paramecia. Mesh ble plassert på en 50-mL tube. (C) Paramecium kultur inneholder ris strå og tørr gjær pellets. (D) Paramecium lagerløsning forberedt fra kulturen i C. (E) Paramecium lagerløsning var skylles med system vann å fjerne mulig olfactory og gustatory signaler i medium. (F) Paramecium innebygd i innspillingen kammeret. Hvis du vil fjerne en del av agarose, ble flere kutt gjort. (G) opptak kammer med en sebrafisk Larven og en paramecium. Fleste av agarose var fjernet for å tillate paramecium å svømme. Leder av sebrafisk Larven er utsatt. (H) oppreist fluorescerende mikroskop brukes i Ca bildebehandling. Mikroskopet er utstyrt med en vitenskapelig CMOS-kamera. (jeg) sebrafisk larve i innspillingen kammeret under mikroskopet med magnetisering lys på. Med en 2,5 X linsen er opplyst området litt større enn størrelsen på kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Representant Ca bildebehandling data. (A) plassering av Pretetto og den underlegne flik av hypothalamus (ILH), sirklet i gult, i en dobbel Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s sebrafisk larve. (B) endringer i pretectum Ca signalet (gjennomsnitt bilateralt), farge-tilordnet til baner av en paramecium i en gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larve. Skala bar: 1 mm. (C) endringer i ILH Ca signalet (gjennomsnitt bilateralt), farge tilordning på baner av en paramecium i en hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s larve. Skala bar: 1 mm. (D) endringer i Pretetto og ILH Ca signaler farge tilordning på baner av en paramecium i en hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s Larven som ble utsatt for to-fotonet laser-ablasjon av den venstre Pretetto. Skala bar: 1 mm. Dette bildet ble gjengitt fra samme data tidligere utgitt21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Byttedyr fange analysen og representant data i laser-ablated sebrafisk larver. (A) atferdsmessige innspillingssystem. Stereomicroscope var utstyrt med en CMOS-kamera. Bildene ble anskaffet bruker et skreddersydd skript. (B) komponenter av belysningssystemet. En mørk papir, en glass diffuser, hvit LED ring lys, diffuser, skreddersydd for avstand (papp) og diffuser med et hull i midten. (C) belysningssystemet samlet fra delene som vises i B. (D) opptak kammer for byttedyr fange analysen. Et kammer (diameter: 20 mm, dybde: 2,5) ble plassert på et glass lysbilde. Opprinnelige topp segl kammeret ble skrellet av. En glass-cover ble satt på opptak kammeret. (E) Raw-bilde fra en ramme av den innspilte filmen. (F) A ramme delt (piksel for piksel) et gjennomsnittlig bilde i en film. Merk at ikke-uniform bakgrunnen i belysning kan kompenseres av denne bildebehandling. (G) Paramecia utdraget rammer ved hjelp av funksjonen "Partikkel analyse" i Fiji. (H) eksempel på bildet i Fiji med en anvendt terskel. Paramecia vises lyse, mens øynene til sebrafisk Larven mørkt og bakgrunnen er grå. Endringer i øyet stillinger (dvs., vinkler med hensyn til kroppen aksen) kan beregnes om nødvendig. (jeg) representant eksperimentelle data av paramecium i en olfactory-pære-ablated kontroll Larven (SR) og en Pretetto-ablated Larven (PT). Pretectum ablasjon betydelig redusert byttedyr jakt evne mens olfactory pære ablasjon ikke påvirke den. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En utmerket romlig oppløsning for å ablate spesielt individuelle neurons har to-fotonet laser bør stor forsiktighet utvises å unngå uønskede skade på hjernevev på grunn av varme. Viktigste i ablasjon eksperimentet er å finne den optimale mengden av laser irradiation. Utilstrekkelig bestråling ikke drepe neurons. For mye bestråling vil varme-skade de omkringliggende vev, som vil resultere i uønskede effekter. Det optimale området av laser irradiation (områder av ROIs, antall gjentakelser og skanning fart) synes å være smal. Noen faktorer som påvirker effektiviteten av ablation.
Først bruker forskjellige fluorescerende reporter proteiner, må ablasjon betingelsene være optimalisert for hver reporter. GCaMP uttrykk er observert i cytoplasma uten kjerner. Derimot vises EGFP fluorescens hele innsiden av cellen, som kan være fordelaktig for effektiv og bestemt ablasjon av målrettet celler, i forhold til GCaMP. Bruk av GCaMP er også uheldig som en laser-ablated GCaMP-uttrykke celle kan vise økt fluorescens intensitet på grunn av umiddelbar Ca tilstrømningen, i motsetning til redusert fluorescens intensiteten i EGFP ble brukt for ablasjon. Endringen i fluorescens kan derfor ikke en pålitelig indikator på omfanget av ablasjon med GCaMP. I slike tilfeller kan det være nødvendig å validere ablasjon ved å observere tap av fluorescerende celler etter en bestemt periode. Fravær eller betydelig reduksjon av Ca signaler i området ablated kan være et annet kriterium for vellykket ablasjon med GCaMP.
Andre kan beløpet (i.e.skannehastighet, gjentakelse antall skanninger) laser irradiation kreves for vellykket ablasjon variere avhengig av dybden på plasseringen av neurons fra overflaten av hjernen. Sammenlignet med celler nær overflaten, krever ligger dypt inni hjernen mer laser irradiation, dermed gjør det vanskeligere å ablate dem. Optimalisering for laser irradiation bør fastsettes spesielt for hver målrettet subpopulation av neurons.
Tredje ble det empirisk observert at innstillingen en rekke ROIs i et lite område i en skanning ofte varme-skadet vevet rundt cellene også (dømt etter utseendet på bobler i området laser-bestrålt), mens målretting en celle alene eller tynt distribuert ROIs i en skanning under samme betingelse har ikke skadelige effekter. Studien, ble bleking brukt bare på et lite område (omtrent en tredjedel av celle kroppen) for å unngå skade vev utenfor målrettet cellene. Vanligvis var 5-10 celler rettet på hver fokalplanet (4-8 plan å dekke hele pretectal området).
Optimalisere mengden laser irradiation, er omfattende validering av laser ablasjon ved å utføre kontroll eksperimenter kritiske. En kontroll-eksperiment kan inkludere laser ablasjon av en annen subpopulasjon av celler som er usannsynlig å være involvert i virkemåten blir studert. Luktelappen neurons merket i samme Gal4 linje var kontroll studien (figur 2A, rett, og figur 5jeg). Imidlertid grunn beskrevet ovenfor kan noen grupper av neurons tjene som en ideell kontroll. Hver subpopulation av neurons er forskjellig fra de andre med hensyn til deres posisjon i hjernen, celle tetthet, fluorescerende reporter transgene uttrykk nivå, spredning hastigheten og tidspunktet for reporter transgene uttrykket. Disse forskjellene gjør det umulig å bruke nøyaktig samme innstilling for ablasjon (funksjonen "Bleking") kontroll eksperimenter. Dermed bør typer kontroll eksperimenter også vurderes, som mål optokinetic svar, visuell atferd28og basale aktiviteten i bevegelse21 å sikre bestemte effekten av ablation.
I vår erfaring tar ablasjon dusinvis av pretectal cellene bilateralt, ca 1 h (fra bygge i agarose, ablasjon bruker en to-fotonet mikroskop, å hente fra agarose etter ablasjon). Opptil 8 Larvene døgnet (f.eks, 4 Larvene eksperimentelle og 4 for kontroll) kan være ablated; Derfor, et par sett av eksperimenter kan være nødvendig å sikre at det er nok Larvene for en eksperimentell gruppe (f.eksn = 12) og en kontrollgruppe (f.eksn = 12). I tillegg er det ønskelig at halv en dag eller en dag for Larvene å gjenopprette fra ablasjon (f.ekslaser ablasjon på 4-dpf etterfulgt av en opptreden innspilling på 5-dpf, eller ablasjon om morgenen etterfulgt av Ca bildebehandling på ettermiddagen). Samtidig utvinning bør noen dårlig ser Larvene ekskluderes fra studien.
Protokollen som brukes til å analysere innhentet data avhenger helt målet med undersøkelsen. Studien fokusert på forholdet mellom plasseringen av paramecium i det visuelle feltet og neuronal aktivitet i Pretetto og ILH. Vurderer den langsomme nedbrytning (~ sekunder) av de GCaMP6s signaler29, bare tidspunktet for økningen, men ikke nedgangen, av GCaMP6s signaler samsvarer med plasseringen av paramecium. Ca signalene kan være høy selv når paramecium scenowe. Derfor, vi bare inkludert økt fluorescens intensiteten av GCaMP6s i datapresentasjonen. Denne typen analyse krever ofte skreddersydd skript skrevet med bestemt programmeringsspråk eller makrospråk. Skript brukes i dette papiret er tilgjengelig på forespørsel.
Behersket tilstand (dvs.agarose-embedded) kan være stressende til sebrafisk Larvene til en viss grad; men observerer vi ikke åpenbar stress-indusert neuronal aktivitet eller opptreden i denne tilstanden, sammenlignet med de frittlevende tilstand21,22. Agarose-innebygd sebrafisk larvae kanne overleve minst 24 h, (sannsynligvis flere) uten tilsynelatende problem. Paramecium-drevet Ca signaler i Pretetto og ILH begrenset til tilstanden var lik som observert i frittlevende Larvene21. Sebrafisk visuelle atferd kan styres av biologiske rytmen. Derfor gjennomførte vi atferdsmessige eksperimenter fra tidlig til sent på kvelden. Wild type og kontroll larver brukt et betydelig antall paramecia samtidig opptak.
De funksjonelle og atferdsmessige analyser beskrevet her bruker oftest tilgjengelig utstyr som kan finnes i mange laboratorier eller kan være å sette opp, og dermed bør det har bred programmer i ulike felt av behavioral science.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse til rapporten.
Acknowledgments
Disse studiene ble finansiert av tilskudd mottatt fra MEXT, JSP KAKENHI Grant tall JP25290009, JP25650120, JP17K07494 og JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
- National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
- Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
