Murina saliv funktionell bedömning via pilokarpin stimulering följande Fractionated strålning
Summary
Vi presenterar en detaljerad strategi att utföra saliv samling, inklusive murina trakeostomi och isoleringen av tre stora spottkörtlar.
Abstract
Muntorrhet är vanligt förekommande i de autoimmun reaktionen av Sjögrens syndrom eller följande strålning skada stora spottkörtlarna. I dessa fall kvarstår frågor vad gäller sjukdomspatogenes och effektiva interventioner. En optimerad teknik som tillåter funktionell bedömning av spottkörtlarna är ovärderlig för att utreda exokrin körtel biologi, dysfunktion och therapeutics. Här presenterar vi ett stegvis tillvägagångssätt att utföra pilokarpin stimulerad saliv sekretion, inklusive trakeostomi och dissektion av tre stora murina spottkörtlarna. Vi detalj också lämpliga murina huvud och hals anatomi nås under dessa tekniker. Detta tillvägagångssätt är skalbart, vilket möjliggör flera möss som ska bearbetas samtidigt, vilket förbättrar effektiviteten i arbetsflödet. Vi strävar efter att förbättra reproducerbarheten av dessa metoder, som alla har ytterligare tillämpningar inom området. Utöver saliv insamling diskuterar vi mätetal för kvantifiering och normalisera funktionella kapaciteten hos dessa vävnader. Representativa uppgifter ingår från submandibular körtlar med deprimerad Saliv-körtel funktion 2 veckor efter fraktionerade strålningen (4 doser av 6,85 Gy).
Introduction
Spottkörteln sjukdomar inkluderar syndrom av dysreglerad eller nedsatt sekretion leder till antingen överproduktion (sialorrhea) eller underproduktion (xerostomi och muntorrhet) av saliv1. I båda fallen finns det ett intresse i att förbättra vår förståelse av spottkörtel biologi mot slutmålet av terapeutisk utveckling2.
Spottkörtlarna är mycket radiosensitive organ, och är ofta skadade under huvud och hals cancer strålbehandling, vilket leder till permanent muntorrhet (xerostomi)3,4. Till skillnad från andra radiosensitive vävnader, dock spottkörtel omsättningshastighet är relativt låg, och mekanismen av sekretoriska förlust är dåligt förstådd5,6. I det här unika skada kräver vävnad förnyelse och strålningsskydd strategier saliv funktionell bedömning. Experimentellt, är murina saliv collection ett särskilt värdefullt verktyg i utvärdera körtel svaret på både strålning och terapeutiska medel.
Här presenterar vi en metod för att utföra och kvantifiera stimulerad saliv sekretion med pilokarpin, en potent muskarina agonister7. Pilokarpin stimulerar det autonoma nervsystemet för att inducera körtel sekret8,9. För att slutföra detta test på lämpligt sätt, är en trakeostomi skyldig att se till att musen upprätthåller luftväg under hela förfarandet, och att minska riskerna för kvävning och aspiration från poolade sekret i munhålan10.
Detta är en terminal förfarande, vilket kulminerade i avlägsnandet av tre stora spottkörtlarna: parotis (PG), submandibular (SMG) och sublinguala (SLG). För funktionella studier, körtel vikter registreras och används ofta för att normalisera saliv mätning11,12,13. Informationen är särskilt viktig i strålning studier, vari körtel atrofi är en förväntade resultatet14,15
Det finns variationer i litteraturen när det gäller hur stimulerad saliv sekretion utförs och rapporteras16. Till exempel pilokarpin doser inom den litteratur span minst tre tiopotenser17,18,19,20,21,22,23. Här presenterar vi en optimerad hög dos pilokarpin protokoll med avsikt att förbättrad reproducerbarhet i metod utförs, samt att ge en modulär plattform av tekniker (trakeostomi, saliv insamling och körtel dissektion) som kan anpassas som behövs.
Förutom protokoll demonstration inkluderar vi representativa funktionella uppgifter av saliv flöde på 2 veckor efter fraktionerade strålningen (4 doser av 6,85 Gy) till regionen SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterar en utgångsämnet metod för att bedöma Saliv-körtel funktion, som kan användas för att studera körtel skada och therapeutics. Vårt förfarande innebär trakeostomi, saliv insamling och körtel dissektion, som alla har experimentella program som kan stödja en integrerad studie av spottkörtel biologi. Murina trakeostomi har exempelvis använts för allmänna airway management under förfaranden som hindrar munhålan.
Ordentlig dissektion och luftrör snitt krävs för pil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av det nationella institutet för tandvård och kraniofaciala forskning (NIDCR) och National Cancer Institute (NCI) av det nationella Institutes of Health under Award nummer R56 DE025098, UG3 DE027695 och F30 CA206296. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health. Detta arbete stöddes också av den NSF DMR 1206219 och IADR Innovation i Oral Care Award (2016).
Vi vill tacka Dr Eri Maruyama och Andrew Hollomon för deras hjälp med saliv samling. Vi vill tacka Pei-Lun Weng för hans hjälp med körtel dissektion. Vi vill tacka Matthew Ingalls för hans hjälp i figur förberedelse. Vi vill tacka Dr Elaine Smolock och Emily Wu för kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O’Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice–the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
