Этот протокол описывает недавно созданный метод для доставки вирус мышиных простаты. Использование технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9, гиперэкспрессия генов или Cre рекомбиназа поставка, техника позволяет ортотопическая изменения экспрессии генов и реализует модель Роман мыши для рака простаты.
Рост заболеваемости раком простаты выявление новых драйверов опухоли или модуляторы имеет решающее значение. Генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) для рака простаты сдерживаются неоднородность опухоли и ее динамика сложных Микроэволюция. Модели мыши традиционных рака простаты включают, среди прочего, микрофлорой и условного нокауты, трансгенных выражение онкогенов и гранулы ксенотрансплантата моделей. Поколение de novo мутаций в этих моделях является сложным, длительным и дорогостоящим. Кроме того большинство традиционных моделей целевой большинство эпителия простаты, в то время как хорошо известно человека рак простаты развиваться как изолированное событие в только небольшое подмножество ячеек. Ценность модели необходимо моделировать не только начало рака простаты, но и прогрессирования заболевания.
Здесь мы описываем метод целевым несколько ячеек путем преобразования клеток в эпителии простаты вирусных частиц. Доставка инженерии вируса в мышиных простаты позволяет изменения экспрессии генов в эпителия простаты. Тип вируса и количество будут настоящим определяется количество целевых ячеек для изменения гена преобразователя несколько клетки для начала рака и многие клетки для генной терапии. Через на основе хирургии инъекций, в передней доле, дистальная от мочевыводящих путей трек опухоли в этой модели можно развернуть без ущерба функцию мочи животного. Кроме того выбирая только подмножество эпителиальных клеток простаты техника позволяет клоновых расширения опухоли и поэтому имитирует человека опухоли посвящения, прогрессии, а также вторжения через базальную мембрану.
Этот роман техника обеспечивает мощный рака простаты модель с улучшение физиологических актуальность. Страдания животных ограничен, и поскольку без дополнительного размножения требуется, уменьшается общая животных игр. В то же время анализ новых генов кандидата и пути ускорения, который в свою очередь является более экономически эффективным.
За последнее десятилетие значительно улучшились обнаружения и лечения рака простаты. Тем не менее растет заболеваемость раком простаты, после ожидаемой продолжительности жизни. С приблизительно 1,1 миллиона новых случаев во всем мире это среди наиболее распространенных причин связанных с раком смерти мужчин 1. Рак предстательной железы является медленным в своем развитии, но когда рак прогрессировала в передовых метастатическим состояние, прогноз плохо из-за ограниченного лечения. Пока только несколько генов были определены как общие драйвера в этой рака, и его неоднородности и multifocality препятствует обнаружению биомаркеров и ориентации болезнь водители2,3.
Классические методы генерации GEMMs часто препятствовали их сложности, своевременно расходы и издержки. Условное нокаут модели широко использовался для изучения рака простаты кандидат гены, которые приводят к эмбриональной летальность при инактивированная микрофлорой4. Наиболее распространенные модели связаны рекомбиназа Cre простат специфического, движимый либо модифицированных Probasin5 или6 промоутер PSA интегрированы в ГЭММ, дополнительные метисации. В этих моделях гена интереса будут направлены в большинстве эпителиальных клеток простаты, генерации гиперплазии в весь орган, который может нарушить животного мочевыделительной функции7.
Вирусная доставки Cre белка путем инъекций в передней доле мышиных предстательной железы может решить эту проблему, только против нескольких клеток8. Принимая во внимание, метод выгоды от широкого круга возможных вариантов лаборатории технические предпосылки, опыт и целей. Успешные подходы, используя аденовирус, Хунб и Pten9 или человека, ориентация Pten и Trp5310 показали среди других. Добавление трансгенов, например Люцифераза, вирусный конструкции или ГЭММ Кроме того позволит Неинвазивный мониторинг прогрессирования заболевания через биолюминесценции изображений11.
Изменения генома, основанный на технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 показывает новая и быстрая возможность изучить рака путем быстрого поколения соматических нокауты12. Вирусная доставки одного руководство РНК (sgRNAs) направлена к передней доле мышиных простаты устанавливает физиологически более соответствующие модели рака простаты. Таким образом отдельные клетки, переноски выбранной мутации могут образовывать клоны, которые способны расширения и вторжения. Кроме того использование руководство РНК для нескольких целевых генов будет создавать клоны клеток с изменениями в различных генов. Это позволит опухоли неоднородность и естественного отбора давления на прогрессии рака, который может выявить важность каждого гена изменения или epistatic механизмов.
Здесь мы представляем способ доставить вирусных частиц в мышиных простаты для изменения экспрессии генов. С небольшой разрез брюшной подвергается мышиных передней доле предстательной железы и вирусных частиц вводят в мочку. Пять дней после операции, хирургические зажимы могут быть удалены с поверхности кожи и рака предстательной железы могут быть проанализированы из 8 недель после. В целом это быстрый и экономичный процедура, которая имеет незначительное влияние на мыши и позволяет больше опухоли развивать без ущерба для мыши.
В этом протоколе мы описываем метод для изменения экспрессии генов в передней доле мышиных предстательной железы путем инъекции вируса, создание мощной новой модели мыши для рака простаты (рис. 2). Успешного управления аденовирус был впервые описан Leow et al. в 2005 году<s…
The authors have nothing to disclose.
Г-н финансировался стипендий от датской онкологическое общество (R146-A9394-16-S2). MFB и MKT финансировались, Нова AUFF (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Г-н и MFB совместно финансируется выпускник школы, здравоохранение, АС. Лаборатория E.F.W. поддерживается грантов от министерства экономики (SAF2015-70857, совместно финансируемые ЕФРР-ЕС) и КЧП расширенный Грант (741888 – CSI-Fun) Испании.
Мы хотим поблагодарить Лилиана Fajardo Меллор (генов, развития и болезней; Национальный онкологический исследовательский центр) для критических чтении рукописи.
Equipment | |||
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
Heating pad | multiple suppliers | ||
Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
Microscope | Leica | different models have been used | |
Reagents | |||
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
Antisedan | obtained from the animal facility | ||
Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
Midazolam | obtained from the animal facility | ||
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Eye ointment | Takeda | 7242 | |
Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |