Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.
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이 논문에서
요약
초록
내가 감각 기관 포유류 실험적인 조작 및 광학 관측의 어려움 때문에 공부에 도전 하. 또한, 기존의 문화 기술을 허용 생화학 물결, 이러한 메서드는 내가 감각 기관의 발달 동안에 기계적인 힘 및 조직 경직 효과 공부 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 여기는 그대로 murine utricle 이러한 한계를 극복 하는 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화에 대 한 방법에 설명 합니다. 여기에 설명 된 3 차원 매트릭스 강성의 조정 위한 기술 조직의 성장 반대 탄성 력의 조작을 허용 합니다. 이 방법은 따라서 내가 개발 하는 동안 기계적인 힘의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다. 또한, 문화 유전자 바이러스 중재 배달, 이득 및 손실-의-기능 실험을 위해 사용 될 수 있는 허용 한다. 이 문화 메서드는 타고 난 세포를 유지 하 고 지 원하는 세포 vestibular 및 청각 감각 기관의 전통적인 2 차원 문화에 대 한 잠재적으로 우수한 대안 역할.
서론
대부분의 포유류 기관 개발 측면의 연구 생체 외에서 시스템에 의해 촉진 되었습니다. 두 가지 주요 방법을 지금 vestibular 감각 기관의 문화에 대 한 사용 된다: 부동성1 및 부착2 . 두 방법 모두 머리 세포 취약점3 및 재생1,4 체 외조사를 허용합니다. 또한, 노치5,6, Wnt7,8, 그리고 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)9,10 신호 계곡 내가의 발달 역할을 설립, 부분적으로, 생체 외에서 문화 감각 epithelia 통해. 그러나, 세포 성장과 분화 제어 됩니다, 뿐만 아니라 세포 외 매트릭스의 강성 morphogens 세포 연락처 등 물리적 및 기계적 신호를 통해 뿐만 아니라....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 록펠러 대학와 남부 캘리포니아의 대학 승인 있다.
1. (선택 사항) 준비 콜라겐의 나 Mouse-tail 힘 줄에서 솔루션
참고: 콜라겐 나 솔루션 상업적으로 사용할 수 있습니다. 젤 준비에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 5-10 젊은 성인 (3-5 주 이전) 마우스 프로토콜 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회16에 의해 승인에 따라 이산화탄소와 어떤 강포한 유형 긴장의 안락사 꼬리를 수집 하 고 실 온에서 4 h의 최소 70% 에탄올에 잠수 하 여 소독.
참고: 그것은 과도 한 조직 탈수에 결과 힘 줄 추출 과정을 방해 이상 48 h에 대 한 보육은 피해 야 한다. - 메스 칼 날 경도 컷을 소개 하 고 집게로 전체 피부를 제거 하 여 각 꼬리에서 피부를 제거 합니다. 100 mm 페 트리 접시와 10 mm 세그먼트로 그들을 잘라 깨끗 한 70% 에탄올으로 가득 차 피부 꼬리를 전송 합니다.
참고: 조작 하기 어려운 꼬리의 가장 얇은 부분을 삭제 합니다....
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결과
Vestibular 및 청각 감각 기관 배아 귀에서 교양 40 Pa 콜라겐에서 내가 젤 낮은 강성 미 발달 조건11을 흉내 낸 상대적으로 정상 차원 구조 (그림 1)를 유지 하 고 세포를 유지 하 고 셀 (그림 2 및 그림 3)를 지원합니다. 30% 이상 감소 셀 밀도 지원 하지만 (스튜던트 t-검정: n = 4, p < 0.004) 머리 세포 밀도 60% 감소 (스튜던트 t-검정: n = 5, p < 0.0001) utricular 문화 (그림 2에서에서 3 일 후 ), 복식 시간11 의 같은 기간 .......
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토론
중재 하십시오 성장 및 개발 하는 동안 내가 차별화 된 분자 신호5,6,7,8,,910광범위 하 게 공부. 그러나 Utricular 모델 시스템에서 얻은 증거는 세포 접합 및 Hippo 신호의 활성화를 통해 감지 기계적 신호 또한 중요 한 역할 이러한 프로세스2,11, 에서 제안 하는, 22. 또한, 모두 감각 상피에서 죽어가는 세포의 압출 및 transdifferentiation 통해 새로운 감각 수용 체의 후속.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리이 프로토콜 기반으로 원래 연구에 그들의 공헌에 대 한 박사 A. 야 코 보, 닥터 제이 Salvi, 그리고 A. Petelski 감사 합니다. 우리 또한 기술 지원 및 축산에 대 한 제이 라마와 W. Makmura을 감사합니다. 우리 R01DC015530, 로버트 슨 치료 개발 기금, 그리고 자금 카루소 가족 재단 NIDCD 부여 NIDCD 훈련 그랜트 T32 DC009975, 인정 합니다. 마지막으로, 우리는 하 워드 휴즈 의학 연구소, 박사 Hudspeth 탐정은 지원을 인정 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #10 수술용 블레이드 | Miltex | 4-110 | |
| #5 집게 | Dumont | 11252-20 | |
| 100mm 페트리 접시 | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL 대형 오리피스 피펫 팁 | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30mm 유리 바닥 페트리 접시 | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 웰 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | 시그마 | H7904 | |
| 60 mm 페트리 접시 | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| 아세트산 | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, 치킨 IgY 분획 | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 항체 (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-글루코스 | 시그마 | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 표피 성장 인자 | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| 섬유아세포 성장 인자 | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| 혈구계 | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| 인슐린 | Sigma | I3536 | |
| 홍채제거 가위 | Zepf 의료 기기 | 08-1201-10 | |
| 마이크로인젝터 | Narishige | IM-6 | |
| 니코틴아미드 | 시그마 | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| 페놀 레드 pH 지시약 | 시그마 | P4633 | |
| 순수 에탄올, 200 프루프 | 데콘 랩스 | 2716 | |
| RFP 항체 | ChromoTek | 5F8 | |
| 소듐 바이카보네이 | 시그마 | S5761 | |
| 소듐 수산화물 | 시그마 | S8045 | |
| 소듐 셀렌나이트 | 시그마 | S5261 | |
| 테이블탑 보텍스 | VWR | 97043-562 | |
| 트랜스페린 | 시그마 | T8158 | |
| 트리판 블루 | 시그마 | T6146 |
참고문헌
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proli....
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