Определение фактора транскрипции Olig2 геномной привязки сайтов в остро очищенный PDGFRα + клеток по иммунопреципитации Chromatin Low клеточной последовательности анализа
Summary
Здесь мы представляем протокол, который предназначен для анализа генома всей привязки Олигодендроциты транскрипционного фактора 2 (Olig2) в клетки-предшественники Олигодендроциты остро очищенный мозга (OPCs), выполнив низким клеточной хроматина иммунопреципитации (чип) , подготовка Библиотека, высокопроизводительного секвенирования и bioinformatic анализ данных.
Abstract
В клетках млекопитающих транскрипции гена регулируются определенным образом клетки типа взаимодействия транскрипционный анализ факторов с геномной ДНК. Линии специфических транскрипционных факторов считаются играть существенную роль в ячейки спецификации и дифференциация во время разработки. Чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) широко используется для анализа сайтов генома общесистемной связывания транскрипционных факторов (или его связанный комплекс) в геномной ДНК. Однако большое количество клеток, необходимы для одного стандартного чип реакцию, которая делает его трудным для изучения ограниченное число изолированных клеток первичной или редкие клеточных популяций. Для того чтобы понять механизм регулирования Олигодендроциты линии конкретных транскрипции показано фактором Olig2 остро очищенный мыши OPCs, подробный метод, с помощью чип seq для выявления генома всей привязки сайтов Olig2 (или Olig2 комплекс). Во-первых, протокол объясняет, как очистить тромбоцитарный фактор роста рецепторов альфа (PDGFRα) положительных OPCs от мыши мозги. Далее Olig2 антител при посредничестве чип и строительство библиотеки выполняются. Последняя часть описывает bioinformatic программного обеспечения и процедуры, используемые для анализа Olig2 чип seq. В целом этот документ сообщает метод для анализа генома всей привязки транскрипционный анализ фактора Olig2 в мозге остро очищенный OPCs.
Introduction
Это важно для изучения белков (или комплекс белков) ДНК привязок и эпигенетических меток для построения транскрипционный анализ регулирования сети, участвующие в различных биологических процессах. Частности привязки транскрипционных факторов в геномной ДНК могут играть важную роль в регуляции гена, дифференцировки клеток и тканей развития. Мощный инструмент для изучения регуляцию и эпигенетические механизмы — иммунопреципитации chromatin (обломока). Благодаря быстрому достижениями в технологии виртуализации следующего поколения чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) используется для анализа привязок протеин дна и эпигеномные марок1. Однако это стандартный протокол чип seq требует около 20 миллионов клеток на реакцию, которая затрудняет применение этой методики, когда номер ячейки ограничено, как отдельные клетки первичной и редких клеточных популяций.
Олигодендроциты линии клеток, включая клетки-предшественники Олигодендроциты (OPCs) и Олигодендроциты широко распространены по всему мозгу и имеют важное значение для развития и функционирования мозга. Как тип клеток-предшественников OPCs способны самообновления и дифференциации. OPCs не только служить прародителями олигодендроциты, но также играют важную роль в распространении нейрональных сигнализации, общаясь с другими типами клеток мозга2. Предыдущие исследования показали, что развитие Олигодендроциты регулируется линии специфических транскрипционных факторов таких как Olig2 и Sox103,4. Эти факторы транскрипции были найдены для привязки к промоутер или усилитель регионах некоторых важнейших генов влиять на их выражение во время Олигодендроциты спецификации и дифференциации. Однако это сложно определить ДНК-связывающих белков (или комплекс белков) интерес к остро очищенный первичной OPCs с очень ограниченное количество клеток.
Этот протокол описывает систематически расследовать геномной ДНК immunoprecipitated по Olig2 в очищенной мыши OPCs в геном-масштабе, используя чип seq технику. OPCs от мыши мозги были остро очищенная методом immunopanning и используется в чип эксперимент без распространения в пробирке. Ограниченное количество OPCs могут быть получены путем immunopanning и является недостаточным для стандартных чип seq экспериментов. Здесь с низким клеточной чип seq протокол как низко как 20 тысяч клеток на чип реакции транскрипционных факторов описан. Вкратце сшитого клетки лизированы и sonicated sonication устройство, чтобы наклонить хроматина. Стриженый хроматина был инкубировали с Olig2 антитела, а также белка A-покрытием бусины в осадок Olig2 антитела связаны геномной ДНК. После элюции от протеина A-покрытием бусы и обратного сшивания геномной ДНК, осаждают Olig2 антитела был очищен путем экстракции фенольных хлороформ. Полученный продукт был количественно и подвергнут T-хвостов, грунтовка, отжиг шаблон коммутации и расширения, адаптеры и амплификации, выбор размера библиотеки и очистки шагов для чип seq библиотека строительства.
После выполнения виртуализации, было проанализировано качество сырья читает из образца, подготовлен с антителом фактор транскрипции Olig2 и образец элемента управления. Пар низкого качества и содержащие адаптер читать фрагменты были обрезаны. Далее, подстриженные чтений были выровняны к геноме мыши ссылку. Геномный регионов, которые были значительно обогатили для читает чип, по сравнению с пример элемента управления, были обнаружены как вершины. Значительные вершины, представляющих потенциальные сайтов связывания фактор транскрипции, были отфильтрованы и визуализированы в браузере генома.
Примечательно метод, описанный в настоящем Протоколе может широко использоваться для чип seq других факторов транскрипции с любой тип клеток ограниченного числа.
Protocol
Representative Results
Discussion
У млекопитающих генных сетей регулирования являются весьма сложными. Чип seq является мощный метод для изучения генома общесистемной протеин дна взаимодействий. Этот протокол включает в себя как выполнять Olig2 чип seq, используя небольшое количество очищенной OPCs от мыши мозги (как низко к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, XD, RCDD и YY были поддержаны грантов от национальных институтов здоровья R01 NS088353; 1R21AR071583 гранта NIH-01; Staman Огилви фонда Мемориальный фонд Hermann; Инициатива UTHealth мозга и CTSA УЛ1 TR000371; и Грант от университета Техаса системы неврологии и нейротехнология научно-исследовательского института (Грант #362469).
Materials
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
