Il protocollo presenta l’ Escherichia coli-base pressione selettiva incorporazione degli aminoacidi non canonico (ncAAs) il lactococcal peptide antimicrobico nisina. Le proprietà possono essere modificate durante l’espressione ricombinante tramite sostituzione con ncAAs desiderata in media di sviluppo definito. Conseguenti variazioni bioattività sono mappati da saggi di inibizione di crescita e microscopia a fluorescenza.
La natura ha una varietà di possibilità per creare nuove proteine funzioni modificando la sequenza dei blocchi di costruzione di singoli aminoacidi. Tuttavia, tutte le variazioni sono basate su 20 aminoacidi canonici (cAAs). Come un modo per introdurre ulteriori proprietà fisico-chimiche in polipeptidi, l’incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAAs) viene sempre più utilizzato in ingegneria proteica. A causa della loro lunghezza relativamente breve, la modifica di peptidi ribosomally sintetizzati e traduzionalmente modificate da ncAAs è particolarmente attraente. Nuove funzionalità e maniglie chimiche possono essere generate da modifiche specifiche di singoli residui. Il metodo di incorporazione (SPI) di pressione selettiva utilizza ceppi auxotrofi host che sono privi di un aminoacido essenziale nei media di crescita chimicamente definite. Strutturalmente e chimicamente simile dell’amminoacido parecchi analoghi quindi attivabili tramite il corrispondente amminoacil-tRNA sintetasi e forniscono specifici residui cAA(s) → ncAA(s) sostituzioni nella sequenza del peptide o della proteina dell’obiettivo. Anche se, nel contesto del metodo SPI, ncAAs sono anche incorporati nel proteoma host durante la fase di espressione del gene ricombinante, la maggior parte delle risorse della cella vengono assegnata per l’espressione del gene dell’obiettivo. In questo modo efficiente incorporazione di residui specifici di ncAAs spesso accompagnato con le quantità elevate di destinazione modificato. Il lavoro presentato descrive l’incorporazione in vivo di sei analoghi di prolina nella nisina peptide antimicrobico, un lantibiotic prodotta naturalmente dal Lactococcus lactis. Proprietà antimicrobiche di nisina può essere cambiato e ulteriormente ampliato durante la sua fermentazione ed espressione in auxotrofi Escherichia coli ceppi in media di sviluppo definito. Quindi, gli effetti della sostituzione di specifici residui di cAAs con ncAAs possono offrire cambiamenti nella specificità e attività antimicrobica. Saggi di attività antimicrobica e microscopia a fluorescenza sono utilizzati per testare le nuove varianti di nisina per inibizione della crescita di un ceppo di batteri Gram-positivi Lactococcus lactis indicatore. Spettroscopia di massa viene utilizzata per confermare l’incorporazione di ncAA in varianti di nisina bioattivi.
La scoperta di antibiotici nel ventesimo secolo e lo sviluppo parallelo di nuovi composti antimicrobici contro microrganismi patogeni abilitati mirati trattamenti delle infezioni batteriche. Tuttavia, a causa della comparsa di patogeni multiresistenti come meticillina-resistente Staphylococcusaureus (MRSA), enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE), MDR (multidrug-resistente) Salmonella typhimurium phage digitare 10 (DT10 ), e Klebsiella pneumoniae, è urgentemente necessario generare nuovi agenti antimicrobici1. Peptidi antimicrobici (amp) sono composti versatili, spesso altamente specifici che sono promettenti candidati per lo sviluppo di nuovi farmaci grazie alle loro proprietà fisico-chimiche, flessibilità, dimensione, idrofobicità e modalità dell’azione2. Amplificatori sono piccoli peptidi solitamente costituito da 7-100 amminoacidi. Spesso, hanno una struttura cationica ricca di caricati positiva residui di lisina e arginina, che interagiscono con la membrana delle cellule microbica mirata, che è carica opposta3. Un particolare sottogruppo di ampere sono peptidi ribosomally sintetizzato e posttranslationally modificato (RiPPs)4. Queste sono prodotte da molti organismi dal Regno dei funghi e il dominio dei batteri. Uno del più noto e ampiamente utilizzato RiPPs è nisina, naturalmente prodotta dal batterio dell’acido lattico Lactococcus lactis (L. lactis). Attivo contro un pannello di batteri Gram-positivi, nisina è stata usata come un biopreservative nell’industria alimentare per più di 50 anni a causa di sue proprietà antimicrobiche e l’assenza di resistenza evoluta in ceppi microbici mirati5. Studi hanno dimostrato che la nisina destabilizza e genera i pori nelle membrane cellulari batteriche, che conduce ad attività antimicrobica contro sia di patogeni Gram-positivi e Gram-negativi6. Legandosi al lipido II, sintesi della parete cellulare batterica sono inibito7. La nisina è codificata da nisA come peptide precursore lineare, che si compone di un leader e una regione del peptide di nucleo (Figura 1). Dopo la sintesi ribosomiale, prenisin in primo luogo viene modificata da deidratasi NisB. Qui, residui di serina e treonina nella regione prepeptide core sono disidratati dehydroalanine (Dha) e dehydrobutyrine (Dhb)8. Successivamente, i residui disidratati sono accoppiati con la cisteina per formare lanthionine anelli (da qui il nome “lantibiotic” per lanthionine anello contenenti antibiotici) tramite un’aggiunta di Michael enzima-catalizzate. Questa modificazione post traduzionale (PTM) è catalizzata dalla ciclasi NisC. In L. lactis, il prenisin modificato viene quindi trasportato fuori dalla cella dal trasportatore NisT e il peptide leader viene scisso della proteinasi NisP per rilasciare la nisina maturi attivi e modulo9. La peptidasi di leader responsabile NisP ha una specificità di substrato alta, poiché esso solo processi modificati nisina efficientemente10.
In generale, attivo RiPPs risultato dall’azione degli enzimi PTM (per esempio NisBC), che aumentano drasticamente lo spazio chimico di brevi peptidi, per esempio, via acetilazione, glicosilazione, metilazione o fosforilazione. Questo livello di complessità può essere ulteriormente espansa dall’incorporazione diretta di ncAAs. Mentre spesso fattibile, sintesi chimica di ampere sono una sfida per la produzione su larga scala a causa della loro complessità strutturale. Ad esempio, la sintesi chimica totale della lactosin lantibiotic S a 71 punti di reazione è stata realizzata con una resa finale del 10% e quella di nisina con una resa di prodotto grezzo di 0,003%11,12. Pertanto, la produzione biologica offre una valida alternativa, a causa della generazione di stereocentri corretta e prodotto ad alta concentrazione.
Fino ad oggi, più di 150 ncAAs, per esempio, avendo gruppi funzionali contenenti fluoro o azidi, sono state integrate di proteine ricombinanti, e diversi esempi di ncAA-modified AMPs sono stati segnalati13,14, 15,16. Con l’introduzione di ncAAs, romanzo proprietà fisico-chimiche possono essere generati rispetto al convenzionale mutagenesi. La diversità dei peptidi esistenti può essere aumentata, possibilmente conducendo a nuovi antibiotici.
Un metodo per l’incorporazione di ncAAs in peptidi ricombinanti è incorporazione di pressione selettiva (SPI) basato sull’impiego di ceppi batterici auxotrofi17. Questi ceppi non sono in grado di sintetizzare l’analogico di cAA corrispondente della ncAA. La metodologia utilizza la specificità di substrato rilassato frequentemente osservato, una caratteristica di molti naturale amminoacil-tRNA sintetasi (aaRSs)18. Oltre a loro substrati naturali di cAA, questi enzimi sono spesso in grado di riconoscere e attivare la ncAA desiderata e caricarla sul loro tRNA(s) cognate. Questo porta a ribosomal incorporazione della ncAA nel prodotto del gene bersaglio in un modo specifico del residuo (cioè, sostituzione di cAA → ncAA). Questo è naturalmente possibile solo quando la ncAA desiderata è strutturalmente e chimicamente simile per l’amminoacido canonica e tollerato dalla fisiologia delle cellule, il macchinario di traduzione e sequenza del peptide o della proteina dell’obiettivo. In una particolare configurazione sperimentale, le cellule ospite auxotrofi sono coltivate in medium definito fornito con una concentrazione di limitazione dell’amminoacido nativo deve essere sostituito. La crescita cellulare o cambio di mezzo privo di cAA conduce a svuotamento intracellulare della cAA. Nel passaggio successivo, viene aggiunto il ncAA e viene indotta l’espressione del gene bersaglio. Inevitabilmente, ncAAs anche ora sono incorporate in molte altre proteine nella cellula ospite durante questa fase dell’espressione genica. Tuttavia, la tossicità del setup SPI è mantenuta a un livello basso in quanto il ceppo di Escherichia coli (e. coli) si trasforma con un plasmide che trasporta il gene bersaglio sotto il controllo di un promotore forte (comunemente il promotore T7 altamente competitivo / Sistema di polimerasi del RNA)19. Immediatamente dopo l’induzione (di solito quando è esaurito il cAA), l’host le cellule smettono di crescere e loro macchinari enzimatiche citoplasmici sono utilizzati principalmente per l’espressione del gene di plasmide-basata su target. Mutagenesi sito-diretta può essere utilizzata per definire i siti di installazione ncAA residuo specifiche nel gene bersaglio20.
Un peptide di modello per l’incorporazione di ncAAs, è stata scelta la nisina AMP pentaciclici A. 34 gli aminoacidi lunghi è solo un residuo della prolina singolo nella sequenza del peptide core (Figura 1). Come in subtilisina, ericin A e S ed epidermina pure come nisina Z e nisina Q, la prolina conservata sembra essere essenziale per attività9,21. La prolina cAA svolge un ruolo particolarmente importante nella rotazione di ammide peptidil-prolil e stabilizzazione di struttura secondaria. Relativa catena laterale anello conformazioni (exo / endo si increspa) sono responsabili di una stabilizzazione termodinamica del legame dell’ammide. Modificazioni chimiche mirate (ad esempio idrossilazioni, fluorazioni, iperomocisteinemici) di prolyl pieghe spesso criticamente influenzano la stabilità, rigidità di impalcatura e le funzioni di molte strutture biologiche22pieghevole. Pertanto, è plausibile aspettarsi che le sostituzioni analogiche di prolina Pro→ saranno dotare anello B, il secondo anello della nisina, romanzo e proprietà insolite.
Qui, una prolina-auxotrofi ceppo di e. coli è stato utilizzato per la produzione di nisina ricombinante. Questo richiede l’espressione del gene prepeptide nisA , nonché la modificazione enzimatica geni nisBC. Il prodotto codificato geneticamente peptide porta un leader N-terminalmente His-tag per cromatografia di affinità tramite purificazione. Per la determinazione dell’attività, L. lactis esprimendo e secernendo NisPT viene utilizzata per attivare le varianti di nisina ricombinante da lisati di Escherichia coli o peptide purificato campioni (Figura 1). L’AMP maturo viene rilasciato dopo la scissione del leader di NisP. In questo metodo di diffusione di agar, il campione di AMP diffonde nel mezzo di una crescita solida e può inibire la crescita del microorganismo gram-positivo. Dopo l’incubazione, questo può essere osservato visivamente da aloni di inibizione di crescita. Oltre L. lactis come indicatore, modificati in varianti di nisina ha mostrati attività antimicrobica contro Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Lactobacillus johnsonii 21,23.
Un metodo alternativo e sperimentalmente diverso per incorporare ncAAs in RiPPs è fermata codone soppressione (SCS)24. Per questo, un tRNA ortogonale / coppia di aminoacyl-tRNA sintetasi (aaRS) è necessaria per la ncAA corrispondente. Idealmente, tutti questi tre componenti sono bioorthogonal, cioè, non interagiscono con l’endogeno tRNAs e aaRSs. Un aaRS ncAA-specifici possono essere generati da modificazione del sito attivo dell’enzima e screening di librerie genetiche di mutanti sintetasi25. Inoltre, l’introduzione di un ncAA richiede un codone che viene riassegnato e che non codifica per la cAA. Comunemente, il codone di stop ambra è usata24,26.
Recentemente, SPI è stato stabilito per l’incorporazione di ncAAs contenenti α-chloroacetamide e clic-chimica-compatibile in NisA27. Ad esempio, Nε– alloc-lisina fu incorporata il lazo peptide captistruin con site-specific (SCS) e metodi di incorporazione di residui specifici (SPI) e successivamente modificate in vitro di rutenio-catalizzata metatesi28 . In confronto a SPI, il metodo SCS è più complicato da un tRNA ortogonale / aaRS coppia deve essere co-espressi. Ad oggi, o coppie per l’incorporazione di prolina sono stati sviluppati29, ma al meglio della nostra conoscenza, nessun esempio di incorporazione analogico prolina è stato segnalato.
Si noti che non tutti i ncAAs possono essere incorporati utilizzando la metodologia SPI. In primo luogo, l’assorbimento di ncAAs nel citoplasma è regolata da una moltitudine di proteine di trasporto che sono incorporati nella membrana citoplasmatica, che è la membrana interna per batteri gram-negativi come e. coli. Normalmente, e. coli è in grado di trasportare una vasta gamma di analoghi dell’amminoacido nella cellula con catene laterali strutturalmente e chimicamente simile alla canoniche aminoacidi. Secondo, molti ncAAs chimicamente reattive o instabile potrebbe agire come un inibitore della crescita cellulare, come essi sono tossici per il metabolismo e la fisiologia dell’ospite cellulare30. Così, l’assorbimento e la tossicità della ncAA per l’host di produzione dovrebbe essere testati in anticipo. Per evitare l’inattivazione del macchinario PTM come effetto collaterale, un setup di espressione strettamente controllata di geni responsabili può essere utilizzato per incorporare l’aminoacido naturale enzimi di modificazione (ad esempio, nisBC) e la ncAA nel gene bersaglio ( ad esempio, nisA). Questo può essere realizzato utilizzando due differenti promotori e induzione dell’espressione genica, come dimostrato in appositi protocolli SPI31. Come indicato sopra, il metodo SPI si basa sulla specificità di substrato rilassato Aars, che consente l’attivazione di ncAA e cognate tRNA ricarica. Successivamente, il tRNA viene recapitato al ribosoma seguita dalla formazione di legami ammidici e pieghevole del peptide bersaglio (poli). In questi processi, revisione ed editing di meccanismi possono diventare rilevanti32. Per questi motivi, è di grande importanza per avere un target ncAA che è strutturalmente e chimicamente simile alla cAA. Altri punti cruciali sono sufficiente stabilità (sia in media crescita ed esposto al metabolismo cellulare) e la solubilità della ncAA. Inoltre, dovrebbe essere disponibile in commercio o facile da essere sintetizzato chimicamente.
Qui, descriviamo un protocollo per SPI, permettendo di incorporazione di residui specifici di ncAAs in RiPPs ricombinante. In particolare, gli analoghi diversi prolina sono incorporati nella nisina peptide antimicrobico A utilizzando Escherichia coli come organismo ospite. Spettrometria di massa viene utilizzata per verificare la sostituzione dell’amminoacido e prodotti peptidici sono analizzati per bioattività mediante saggi di inibizione di crescita e microscopia di fluorescenza usando ceppi microbici indicatore.
Il requisito di base per l’espressione di successo nisina ricombinante con ncAAs definito richiede una prolina adatta auxotrofico ceppo di e. coli . Per questo Auxotrofia, proA dev’essere disfunzionale, genomica KO per esempio raggiunto. Le cellule completamente private della biosintesi di Pro intracellulare (cioè, l’eliminazione di proABC) senza possibilità di ripristino sono auxotrophs stabile. Trasduzione dei fagi o singolo gene knockout secondo Datsenko & Wanner33sono ampiamente usate gene knockout metodi. Inoltre, ceppi di knockout proA sono ottenibili da archivi pubblici come Addgene, CGSC o la raccolta di Keio. Poiché l’espressione ricombinante nisABC illustrato di seguito si basa sull’uso di promotori di T7, il ceppo di host espressione deve trasportare un gene inducibile per T7 RNA polimerasi. Questo è possibile tramite introduzione del profago λDE3 nel genoma ospite, ad esempio utilizzando il kit commerciale. In alternativa, ceppi ad esempio BL21 (DE3) possono essere fatta auxotrofi come descritto sopra.
Utilizzando SPI per l’inserimento degli analoghi di prolina, le strutture di nisina mirato possono essere sostanzialmente modificate, creando varianti peptide novello con combinazioni di sequenza univoca e proprietà chimiche. In questo modo, può essere aggirato il limite di base della tecnologia genetica classica, che è vincolato a composizioni chimiche di catena il lato del 20 cAAs. In vivo chimica diversificazione della nisina come esemplificato sopra dimostra un approccio generale per integrare PTMs naturale e migliorare drammaticamente dallo spazio chimico di RiPPs. Noi crediamo che ampliando il repertorio degli aminoacidi naturali rappresenta una grande promessa soprattutto per amplificatori. In proteine, una straordinaria gamma di funzionalità può essere realizzata attraverso una disposizione definita della 20 cAAs in strutture tridimensionali. Con solo 7-100 aa in lunghezza3, modi per ottenere tali caratteristiche strutturali solo attraverso cAAs sarebbe limitati per amplificatori. Non sorprende quindi che ampli naturale in forma di RiPPs comunemente sono ampiamente traduzionalmente modificate4. Allo stesso modo, ncAAs come blocchetti di costruzione alternativi promettono grandi per migliorare i loro parametri farmacodinamici e farmacocinetici (vedere Baumann et al 201735 e riferimenti ivi).
La metodologia SPI utilizzata in questo lavoro beneficia di un relativamente facile messa a punto sperimentale, esecuzione semplice e alta riproducibilità. A causa di sostituzione globale, multisito incorporazione di ncAA in peptidi di destinazione è anche fattibile. D’altra parte, il metodo potrebbe non essere adeguato per la sostituzione di aminoacidi che accade frequentemente nel prodotto del gene bersaglio. In linea di principio, posizioni indesiderati possono essere modificati mediante mutagenesi sito-diretta, ma queste modifiche aggiuntive potrebbero anche interessare parecchie proprietà di AMP compreso struttura e bioattività. Una volta disponibile un ceppo auxotrofico per produzione, ncAAs diversi possono essere testati senza richiedere modifiche estese a livello genetico. Inoltre, il metodo non è limitato a auxotrofi Escherichia coli ceppi, ma può essere eseguita anche utilizzando l’host di produzione naturale. Ad esempio, Zhou et al hanno dimostrato che SPI per la produzione di Novello RiPPs funziona anche naturalmente Trp-auxotroph L. lactis: utilizzo definita media, tre analoghi di triptofano sono stati incorporati a quattro posizioni in nisina50.
Poiché il metodo SPI conduce alla sostituzione globale del scelto cAA dalla ncAA, è generalmente applicabile ad una vasta gamma di destinazione peptidi e proteine. Una gamma di auxotrofi Escherichia coli ceppi è disponibile (Vedi punto 1), permettendo diverse cAAs ciascuno per essere testato per la sostituzione di ncAAs. Incontrato analoghi incorporati utilizzando metA-ceppi carenti (ad es., B834(DE3)) più comunemente sono impiegati. Esempi di isostrutturale Met analoghi sono azidohomoalanine (Aha) e homopropargylglycine (Hpg), ncAAs disponibili in commercio che possono essere incorporati in modo efficiente. Entrambi introdurre bioorthogonal maniglie che consentono l’aggancio di molecole che trasportano un alchino compatibile o funzionalità di azide, rispettivamente. Ad esempio, le tinture fluorescenti o moiety polietilenglicole (PEG) può essere fissato da rame (I)-catalizzata azide alchino cicloaddizione (CuAAC)51.
Anche se entrambi metodi di incorporazione di ncAA ricombinante (SPI e SCS) solitamente ottenere quantità sufficienti di destinazione, i rendimenti sono spesso ridotti rispetto alla produzione di selvaggio-tipo del corrispondente peptidi e proteine. Come le purezze spesso correlano con l’efficienza di produzione, fasi di purificazione supplementare possono essere richiesti, soprattutto per specie basso-abbondante. In questo caso particolare di produzione ricombinante nisina, la sequenza leader His-tag semplifica notevolmente RiPP purificazione di arricchimento selettivo dai lisati cellulari. La purificazione mostrata in questo protocollo migliora la purezza e la concentrazione della nisina, ma spesso non produce purezze AMP sufficiente per determinare il rendimento e l’attività specifica. Oltre a IMAC, metodi di purificazione AMP comunemente usati includono HPLC, cromatografia a scambio ionico (IEC) e precipitazioni (per esempio. utilizzando acetone o acido tricloroacetico (TCA)) o combinazioni degli stessi – risultante in un schema di purificazione multistep52 . Dovrebbe essere notato che loro comunemente natura polycationic può facilitare la purificazione di IEC. Liofilizzazione è frequentemente utilizzato per memorizzare AMPs purificata.
Idealmente, ncAAs per incorporazione in ampere dovrebbe essere disponibile in commercio a prezzi accessibili o facilmente prodotte dai protocolli di sintesi chimica semplice e riproducibile. Un altrettanto importante prerequisito per il metodo SPI è che la ncAA è riconosciuto, attivato e addebitato sul tRNA cognate delle RAA endogene o co-espresse. Questo può essere testata in vitro dall’aminoacido attivazione o tRNA aminoacylation dosaggio53. Come un’alternativa facile, espressioni di test SPI di proteine modello come proteina fluorescente verde (GFP) condotto sia in presenza e in assenza del completamento di ncAA possono essere eseguite. Inoltre, solubilità nella permeabilità di medium e delle cellule di crescita così come stabilità chimica costituiscono fattori importanti.
In questo esempio, l’attività antimicrobica è stato proiettato utilizzando un ceppo di batteri Gram-positivi indicatore. Come esprime la peptidasi leader NisP, la fase finale di maturazione di nisina è catalizzata. Rimozione della sequenza leader (His-tag per scopi di purificazione) possono anche essere eseguiti in vitro dal trattamento con purificato NisP50 o tripsina54. Oltre lo scopo di questo lavoro, organismi patogeni e ceppi multiresistenti possono poi essere testati per inibizione battericida o batteriostatica di AMPs utilizzando una metodologia simile. Specie bersaglio clinicamente rilevanti includono MRSA, MDR tubercolosi del micobatterio, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Oltre alla diffusione di piastra di agar analisi presentati qui, crescita inibizione può essere eseguita anche utilizzando appropriati mezzi liquidi inoculati con le specie batteriche e completati con AMP. Utilizzando metodi di diluizione in brodo, la concentrazione inibitoria minima (MIC) può essere determinata utilizzando peptidi puro55. L’analisi di attività qui presentata è utilizzabile anche per stimare la bioattività e la potenza di soluzioni contenenti AMP relativi composti di riferimento, ad esempio commercialmente disponibile nisina.
Produzione ricombinante di RiPPs è spesso fattibile39, che comprende comunemente co-espressione di geni PTM. Non appena il ceppo di produzione viene trasferito in un medium minimo chimicamente definito o sintetico contenente un adatto ncAA, sostituzione di residui specifici della cAA corrispondente si svolge. Così, altri RiPPs può essere prodotto dalla stessa metodologia, purché la loro produzione ricombinante è fattibile e condizioni possono essere trovate dove incorporazione di ncAA e PTM producono una quantità sufficiente di prodotto di destinazione. Si noti che oltre il proteoma cellulare di host, il macchinario PTM peptide può anche diventare ncAA-modificato durante SPI. Di conseguenza, i tempi di induzione di espressione di destinazione e il seguente periodo di incubazione può richiedere ottimizzazione. Poiché incorporazione ncAA gli enzimi PTM può influenzare la stabilità e l’attività, la produzione della RiPP trasformati può in linea di principio essere influenzata. L’efficacia di enzima PTM sufficiente è indicato dalla formazione di prepeptide trasformati, come rilevato dalle analisi MS e bioattività. Come introdotto sopra, differenti promotori inducibili potrebbero essere impiegati per produrre il PTM geni prima (in assenza di ncAA) seguirono da induzione del gene precursore del peptide in presenza della ncAA. In generale, la produzione del peptide cAA-contenente di destinazione dovrà essere eliminata prima dell’aggiunta della ncAA, ragion per cui stretta repressione del gene precursore è richiesta. All’interno di questo protocollo, questo si ottiene dalla repressione catabolica attraverso l’aggiunta di glucosio per mezzo di crescita. Soprattutto perché gli enzimi PTM richiesti per l’elaborazione prepeptide provengono solitamente da un host geneticamente distante, utilizzo di temperatura e codone dell’espressione dei geni corrispondenti possa richiedere ottimizzazione se produzione ricombinante non è ancora stato stabilito. In linea di principio, la presenza di ncAAs nel prepeptide possa interferire con il riconoscimento e l’elaborazione degli enzimi PTM, nel caso di nisina NisBC e NisP. Per incorporazione di ncAA in AMPs, pertanto è consigliabile eseguire esperimenti su scala ridotta espressione in primo luogo per identificare condizioni di espressione adatto e l’affidabilità del dosaggio attività AMP.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. e M.B. riconosce finanziamenti dal programma UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. e T.F. riconosce finanziamenti dal Ministero federale dell’educazione e scienza (BMBF programma “HSP 2020”, TU-WIMIplus progetto SynTUBio) e la Fondazione di ricerca tedesca (Cluster of Excellence “Unifying concepts in catalisi”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |