مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران
Summary
هنا نقدم بروتوكول مفصلة للقيام في فيفو تحرير القلب الجينات في الفئران استخدام المؤتلف “أدينواسوسياتيد الفيروس” (راف)-بوساطة تسليم كريسبر. هذا البروتوكول يوفر استراتيجية علاجية واعدة لعلاج اعتلال عضلة القلب تندب في ضمور العضلات دوشين، ويمكن استخدامها لتوليد الدفع الخاصة بالقلب في الفئران بعد الولادة.
Abstract
النظام (كريسبر) تكرار متفاوت المسافات، إينتيرسباسيد بانتظام، وباختصار، المتناوب سهلت إلى حد كبير هندسة الجينوم في استزراع الخلايا والكائنات الحية من مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع. كما تم استكشاف التكنولوجيا كريسبر كعلاجات جديدة لعدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. بيانات إثبات المفهوم مشجعة جداً كما يتضح من الدراسات التي أجريت مؤخرا أن البرهنة على جدوى وفعالية النهج العلاجي القائم على تحرير الجينات لضمور العضلات دوشين (DMD) باستخدام نموذج مورين. على وجه الخصوص، قد مكن rh.74 النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة (راف) (rAAVrh.74) بالحقن الوريدي وداخل كفاءة تقديم القلب المكوّرات العنقودية الذهبية المرتبطة كريسبر البروتين 9 (SaCas9) واثنان دليل الكشف (جرنة) حذف منطقة الجينوم مع كودون المسخ في إكسون 23 جينات Dmd الماوس. يمكن أيضا استخدام هذا النهج نفسه لضرب الجينات من الاهتمام والدراسة وظيفة القلب في الفئران بعد الولادة عند جرنة صمم لاستهداف منطقة ترميز الجينات. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيل كيفية هندسة المتجهات كريسبر rAAVrh.74 وكيفية تحقيق كفاءة عالية تسليم القلب في الفئران حديثي الولادة.
Introduction
متفاوت المسافات، إينتيرسباسيد بانتظام، قصيرة المتناوب تكرار (كريسبر) التكنولوجيا يمثل تقدما آخر في هندسة الجينوم وقد أحدثت ثورة في الممارسة الحالية لعلم الوراثة في الخلايا والكائنات الحية. التحرير على أساس كريسبر الجينوم يستخدم دليل واحد الحمض النووي الريبي (جرنة) لتوجيه endonuclease كريسبر المرتبطة مثل البروتينات المرتبطة كريسبر 9 (Cas9)، و Cpf1 إلى هدف الحمض النووي جينومي مكملة في التسلسل بروتوسباسير المشفرة بواسطة جرنة مع بروتوسباسير محددة عزر المتاخمة (بام)1،2. بام يختلف حسب الأنواع البكتيرية من الجينات Cas9 أو Cpf1. تسلم نوكلياسي Cas9 الأكثر استخداماً المستمدة من العقدية المقيّحة (SpCas9) تسلسل بام نج التي وجدت في المصب مباشرة من تسلسل الهدف في الحمض النووي، في ستراند غير المستهدفة. توليد بروتينات Cas9 و Cpf1 في الموقع المستهدف، وفاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، الذي يتم إصلاحه ثم عبر الجوهرية آليات إصلاح الحمض الخلوي بما في ذلك الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة (نهيج) و مسارات الإصلاح الموجه من التماثل (HDR)3، 4. نظراً لغياب قالب الحمض النووي جزئ مثلى، جهاز تسوية المنازعات هو أساسا إصلاحه من قبل مسار نج عرضه للأخطاء، مما يمكن أن يسفر عن عمليات الإدراج أو الحذف (إينديلس) من النيوكليوتيدات التي تسبب الطفرات فراميشيفت إذا تم إنشاء هيئة تسوية المنازعات في الترميز المنطقة من5،الجينات6. وبالتالي، النظام كريسبر قد استخدمت على نطاق واسع مهندس الطفرات الخسارة من الدالة في مختلف النماذج الخلوية والكائنات الحية كلها، من أجل التحقيق في وظيفة الجينات. وعلاوة على ذلك، حفازة نشطة Cas9 و Cpf1 قد وضعت على ترانسكريبتيونالي وتعدل ابيجينيتيكالي التعبير عن الجينات الهدف7،8.
في الآونة الأخيرة، حزم SpCas9 و SaCas9 (مشتقة من المكوّرات العنقودية الذهبية) إلى نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف (راف) لتصحيح الجينات بعد الولادة في نموذج الحيوان للأمراض التي تصيب الإنسان، وخاصة دوشين ضمور العضلات (DMD)9،10،11،،من1213،،من1415. DMD هو العاشر مرتبطة المتنحية مرض قاتل الناجم عن الطفرات في الجينات إعلان الدوحة الوزاري ، الذي يشفر ديستروفين البروتين16،17، التي تؤثر على حوالي واحد في 3500 المواليد الذكور وفقا لفحص حديثي الولادة18 , 19-يتميز بضعف العضلات التدريجي والهزال. المرضى DMD عادة ما تفقد القدرة على المشي بين 10 و 12 سنة من العمر ويموتون بسبب فشل في الجهاز التنفسي و/أو القلب في سن 20-30 سنة20. جدير بالذكر أن تطور اعتلال عضلة القلب في > 90% من المرضى DMD ويمثل السبب الرئيسي الوفاة في إعلان الدوحة الوزاري المرضى21،22. على الرغم من أن ديفلازاكورت (العقاقير المضادة التهاب) واتيبليرسين (إكسون تخطي الطب لتخطي إكسون 51) مؤخرا تمت الموافقة على إعلان الدوحة الوزاري بالغذاء والدواء (FDA)23،24، أيا من هذه العلاجات تصحيح العيوب الوراثية على مستوى الحمض النووي الجينوم. الماوس mdx، الذي يحمل طفرة نقطة في إكسون 23 الجينات ديستروفين، قد استخدمت على نطاق واسع ك نموذج إعلان الدوحة الوزاري25. وعلاوة على ذلك، أثبتنا سابقا أن استعيد التعبير ديستروفين الوظيفية قبل الحذف في إطار من الحمض النووي الجينوم يغطي exons 21 و 22 و 23 في عضلات الهيكل العظمى من الفئران mdx استخدام التسليم Ad-SpCas9/جرنة العضلي9 ، وفي عضلات القلب mdx/أوتروفين+/– الفئران باستخدام التسليم rAAVrh.74-SaCas9/جرنا عن طريق الحقن الوريدي وداخل26.
ونحن في هذا البروتوكول، تصف بالتفصيل كل خطوة في تحرير الجينات القلب بعد الولادة لاستعادة ديستروفين mdx/أوتروفين+/– الفئران باستخدام ناقلات rAAVrh.74-SaCas9/جرنا، من تصميم جرنا إلى تحليل ديستروفين في المقاطع عضلة القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتحقيق في فيفو تحرير القلب الجينات في الفئران بعد الولادة باستخدام التسليم بوساطة rAAVrh.74 SaCas9 وهما جرناس. كما تمت الإشارة سابقا، يمكن استخدام هذا النهج لاستعادة تعبير ديستروفين في الفئران تندب كما هو موضح في العمل لدينا27<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة المنح (R01HL116546 و R01 AR064241) الصحة الإنجابية.
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
References
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
