Un modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine chez le poisson zèbre adulte
Summary
On décrit ici une méthode pour générer un modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine dans adult poisson zèbre (Danio rerio). Deux autres moyens d’injection intrapéritonéale sont présentés et conditions afin de réduire les écarts entre les différents groupes expérimentaux sont discutées.
Abstract
Le poisson-zèbre adult génétiquement accessible (Danio rerio) a servi plus en plus comme un modèle de vertébrés pour la compréhension des maladies humaines telles que la cardiomyopathie. En raison de sa commodité et susceptibilité aux manipulations génétiques à haut débit, la génération de modèles de cardiomyopathie acquises, tel que le modèle de cardiomyopathie induite par la doxorubicine (DIC) chez le poisson zèbre adulte, ouvre les portes à nouvelles pistes de recherche, y compris les modificateurs de cardiomyopathie par dépistage génétique avant de découvrir. Différent du modèle DIC zebrafish embryonnaire, tant initiale aiguë et plus tard des phases chroniques de cardiomyopathie peuvent être déterminés dans le modèle de poisson-zèbre adulte DIC, permettant l’étude des mécanismes de signalisation dépendant de la scène et stratégies thérapeutiques. Toutefois, les résultats variables peuvent être obtenus avec le modèle actuel, même dans les mains des enquêteurs expérimentés. Pour faciliter la mise en oeuvre future du modèle DIC, nous présentons un protocole détaillé sur la façon de générer ce modèle DIC chez le poisson zèbre adulte et décrire les deux autres moyens d’une injection intrapéritonéale (IP). Nous continuer à discuter des moyens de réduire les variations pour obtenir des résultats fiables et de formuler des suggestions sur la façon d’interpréter correctement les résultats.
Introduction
Doxorubicine (DOX), également appelée adriamycine, a été conçu comme un médicament anti-néoplasique depuis les années 19601,2. Il est maintenant toujours activement utilisé comme un médicament chimiothérapeutique important pour un large éventail de tumeurs. Toutefois, l’application clinique des DOX est harcelée par sa toxicité dose-dépendante, surtout de cardiotoxicité caractérisée par des symptômes variables allant de changements électrocardiographiques asymptomatiques à la péricardite et décompensation cardiomyopathie 1 , 2. a ce jour, au moins trois hypothèses principales ont été soulevées pour expliquer la DIC, y compris activés réactives de l’oxygène (DRO)1,3,4,5, inhibition de la topoisomérase II-β () TOP2β)6,7et modulation du calcium intracellulaire version1,8,9. Accumulation de preuves suggère également une prédisposition génétique comme un facteur de risque essentiel pour DIC10,11,12,13. Identités de gènes associés à ces prédispositions DIC, cependant, demeurent largement inconnus. Dexrazoxane est le seul agent adjuvant approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour traiter la DIC, mais avec la mise en œuvre limitée14,15,16, soulignant la nécessité d’identifier les autres stratégies thérapeutiques. Modèles animaux de DIC on explore donc à ces fins. En raison de leur accessibilité et de simplicité, études mécanistes sur modèles DIC pourraient avoir des répercussions plus larges sur d’autres types de cardiomyopathies : pathogénie commune pouvant être partagé entre les cardiomyopathies d’étiologies différentes, surtout au plus tard les stades pathologiques17,18,19,20.
En plus de modèles de rongeurs du DIC, modèles DIC du poisson-zèbre avec des débits plus élevés ont été développés pour faciliter la découverte de nouveaux facteurs génétiques et de thérapeutique. Un modèle DIC embryonnaire a été établi chez les embryons de poisson-zèbre transparent pour le dépistage de composés thérapeutiques21. Étant donné que les cardiomyopathies sont des maladies à déclenchement adulte avec une pathogénie progressive, poisson zèbre adulte cardiomyopathie modèles ont été mis au point22,23,24,25,26. Nous avons généré le premier modèle acquis Cardiomyopathies résultant d’une anémie chronique24, suivi par DIC comme le deuxième modèle de cardiomyopathie acquis dans le poisson-zèbre adulte23. Nous avons constaté que l’injection d’un bolus de DOX dans le poisson-zèbre adulte induit cardiotoxicité qui consiste en une phase aiguë à peu près au sein de post-injection 1semaine (wpi), suivie par une phase chronique de la cardiomyopathie jusqu’après l’injection 6 mois. Tandis que Sim1 de la cible mécaniste de la rapamycine(mtor) améliore la cardiomyopathie à la phase chronique, il exagère la mortalité de poissons à la phase aiguë, soulignant la valeur du modèle adulte DIC à discerner le stade-dépendante mécanismes,23. De plus, nous avons démontré que le modèle adult de la DIC peut servir à souligner une collection de poissons zèbres insertional cardiaque (ZIC) mutants qui sont générés par une approche de mutagenèse insertionnelle axée sur le transposon27. Un pilote écran identifié 3 gènes connus cardiomyopathie ainsi que DnaJ (Hsp40) homologue, sous-famille B et membre 6 b (dnajb6b) comme nouveau DIC susceptibilité gènes28. Par conséquent, la génération du modèle DIC adulte chez le poisson zèbre a conduit à une nouvelle méthodologie qui permet systématiquement l’identification des modificateurs génétiques pour DIC, qui complète l’étude Génome-large association existante (GWAS) et le locus de caractères quantitatifs (QTL ) analyse.
Au cours de la production et la mise en œuvre du modèle DIC adult poisson-zèbre, nous avons remarqué des variations importantes entre les différents chercheurs ou même parmi les différentes injections effectuées par le même chercheur. La nature longitudinale du modèle impose des défis à l’enregistrement des résultats des différents enquêteurs et du processus de dépannage séquentiels. Pour faciliter l’utilisation de cette méthode simple de stress induisant la cardiomyopathie par la communauté scientifique, nous décrire notre protocole en détail, présentes deux types d’injection Intrapéritonéale et discuter des considérations afin de réduire les écarts entre les différents chercheurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour modéliser un DIC progressive, la dose de 20 mg/kg DOX a été déterminée expérimentalement que la dose la plus élevée qui ne cause pas la mort de poissons importants pendant 1 wpi, mais encore de résultats dans la mort de poissons et la diminution de la fonction cardiaque après 4 wpi (Figure 3 et Figure 4). Cette dose est comparable à ceux qui sont fréquemment utilisés dans les modèles de DIC rongeurs (15-25 mg/kg) et à la dose cumulative de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (14SDG18160021 à YD), l’américain NIH R01 accorde HL 81753 et HL 107304 à XX et la Fondation Mayo à XX.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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