En metod för att generera en doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar (Danio rerio) beskrivs här. Två alternativa sätt att intraperitoneal injektion presenteras och villkor att minska variationer bland olika experimentella grupper diskuteras.
Den genetiskt tillgänglig vuxen zebrafiskar (Danio rerio) har använts alltmer som en vertebrate modell för att förstå mänskliga sjukdomar såsom kardiomyopati. På grund av dess bekvämlighet och föredragandens till hög genomströmning genetiska manipulationer, öppnar generering av förvärvade kardiomyopati modeller, såsom doxorubicin-inducerad kardiomyopati (DIC) modellen i vuxen zebrafiskar, dörrar till nya forskning avenyer, inklusive att upptäcka kardiomyopati modifierare via framåt genetisk screening. Skiljer sig från den embryonala zebrafiskar DIC modellen, både initial akut och senare kroniska faser av kardiomyopati kan bestämmas i vuxen zebrafiskar DIC modellen möjliggör studier av scenen-beroende signalering mekanismer och terapeutiska strategier. Dock kan varierande resultat erhållas med den nuvarande modellen, även i händerna på erfarna utredare. För att underlätta framtida genomförande av DIC modellen, presenterar vi ett detaljerat protokoll på hur till generera DIC modellen adult zebrafiskar och beskriva två alternativa sätt att intraperitoneal (IP) injektion. Vi diskutera ytterligare alternativ att minska variationer för att få tillförlitliga resultat och ge förslag på hur man på lämpligt sätt tolka resultaten.
Doxorubicin (DOX), Adriamycin, som också heter har utvecklats som en antineoplastiska läkemedel sedan 1960-talet1,2. Nu är det fortfarande används aktivt som en viktig kemoterapeutiska läkemedel för ett brett spektrum av tumörer. Dock klinisk tillämpning av DOX hämmades av dess dosberoende toxiciteter, särskilt kardiotoxicitet kännetecknas av varierande symtom från asymtomatiska elektrokardiografiska förändringar till perikardit och dekompenserad kardiomyopati 1 , 2. hittills har minst tre stora hypoteser har framförts för att förklara DIC, inklusive aktiverat reaktivt syre arter (ROS)1,3,4,5, hämning av topoisomeras II-β ( TOP2β)6,7, och modulering av intracellulära kalcium release1,8,9. Ackumulerande bevis föreslår också genetiska anlag som en central riskfaktor för DIC10,11,12,13. Gen identiteter relaterade till dessa DIC anlag, kvarstår dock till stor del okända. Dexrazoxan är den enda adjuvant agent godkänd av oss Food and Drug Administration (FDA) att behandla DIC, men med begränsad genomförande14,15,16, vilket understryker behovet av att identifiera ytterligare terapeutiska strategier. Djurmodeller av DIC utforskas därför för dessa ändamål. På grund av deras tillgänglighet och enkelhet, mekanistiska studier på DIC modeller kan potentiellt ha bredare effekter på andra typer av kardiomyopatier: gemensam patogenes kan delas mellan kardiomyopatier av olika etiologier, särskilt på senare patologiska stadier17,18,19,20.
Förutom gnagare modeller av DIC, har zebrafiskar DIC modeller med högre genomströmning utvecklats för att underlätta upptäckten av nya genetiska faktorer såväl therapeutics. En embryonala DIC-modell har fastställts i genomskinliga zebrafiskar embryon för screening terapeutiska föreningar21. Med tanke på att kardiomyopatier är vuxen debut sjukdomar med en progressiv patogenes, utvecklat vuxen zebrafiskar kardiomyopati modeller har22,23,24,25,26. Vi skapade den första förvärvade modellen för kardiomyopati som följd av kronisk anemi24, följt av DIC som den andra förvärvade kardiomyopati modellen adult zebrafiskar23. Vi hittade att injektion av en engångsbolus av DOX i vuxen zebrafiskar inducerar kardiotoxicitet som består av en akut fas ungefär inom 1 vecka efter injektion (wpi), följt av en kronisk fas av kardiomyopati till 6 månader efter injektionen. Medan haploinsufficiency mekanistiska målet på rapamycin(mtor) ameliorates kardiomyopati vid kronisk fas, överdriver det fisk dödlighet på den akuta fasen, betonar värdet av vuxen DIC modellen att urskilja scenen-beroende mekanismer23. Vi visade vidare att den vuxna DIC-modellen kan användas att betona en samling av zebrafisk insertional hjärt (ZIC) mutanter som skapas via en transposon-baserade insertionsmutationer tillvägagångssätt27. En pilot skärm identifierade 3 kända kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, underfamilj B och medlemmen 6b (dnajb6b) som nya DIC känslighet gener28. Därför generationen av vuxen DIC modellen i zebrafiskar ledde till en ny metod som systematiskt möjliggör identifiering av genetiska modifierare för DIC, som kompletterar befintliga genome-wide association-studier (GWAS) och kvantitativa locus (QTL ) analys.
Under generering och genomförandet av modellen adult zebrafiskar DIC märkte vi betydande variationer mellan olika forskare och/eller även bland olika injektioner utförs av samma prövaren. Den längsgående naturen av modellen medför utmaningar att registrera resultat från olika undersökare och sekventiell felsökningsprocessen. För att underlätta användningen av denna enkla kardiomyopati-inducerande stress metod av gemenskapens forskning, vi beskriva våra protokoll i detalj, finns två typer av IP-injektion, och diskutera överväganden för att minska variationer mellan olika forskare.
För att modellera en progressiv DIC, bestämdes dosen 20 mg/kg DOX experimentellt som den högsta dos som inte orsakar betydande fisk dödsfall under 1 wpi men ändå resultat i fisk död och minskning av hjärtfunktion efter 4 wpi (figur 3 och Figur 4 c). Denna dos är jämförbara som ofta används i gnagare DIC modeller (15-25 mg/kg) och att den gräns kumulativa dosen för människor (550 mg/m2, vilket motsvarar 15 mg/kg)4</sup…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis av en vetenskapsman utveckling bidrag från American Heart Association (14SDG18160021 till YD), den amerikanska NIH R01 beviljar HL 81753 och HL 107304 till XX och XX Mayo stiftelsen.
Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |