Summary

Doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

En metod för att generera en doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar (Danio rerio) beskrivs här. Två alternativa sätt att intraperitoneal injektion presenteras och villkor att minska variationer bland olika experimentella grupper diskuteras.

Abstract

Den genetiskt tillgänglig vuxen zebrafiskar (Danio rerio) har använts alltmer som en vertebrate modell för att förstå mänskliga sjukdomar såsom kardiomyopati. På grund av dess bekvämlighet och föredragandens till hög genomströmning genetiska manipulationer, öppnar generering av förvärvade kardiomyopati modeller, såsom doxorubicin-inducerad kardiomyopati (DIC) modellen i vuxen zebrafiskar, dörrar till nya forskning avenyer, inklusive att upptäcka kardiomyopati modifierare via framåt genetisk screening. Skiljer sig från den embryonala zebrafiskar DIC modellen, både initial akut och senare kroniska faser av kardiomyopati kan bestämmas i vuxen zebrafiskar DIC modellen möjliggör studier av scenen-beroende signalering mekanismer och terapeutiska strategier. Dock kan varierande resultat erhållas med den nuvarande modellen, även i händerna på erfarna utredare. För att underlätta framtida genomförande av DIC modellen, presenterar vi ett detaljerat protokoll på hur till generera DIC modellen adult zebrafiskar och beskriva två alternativa sätt att intraperitoneal (IP) injektion. Vi diskutera ytterligare alternativ att minska variationer för att få tillförlitliga resultat och ge förslag på hur man på lämpligt sätt tolka resultaten.

Introduction

Doxorubicin (DOX), Adriamycin, som också heter har utvecklats som en antineoplastiska läkemedel sedan 1960-talet1,2. Nu är det fortfarande används aktivt som en viktig kemoterapeutiska läkemedel för ett brett spektrum av tumörer. Dock klinisk tillämpning av DOX hämmades av dess dosberoende toxiciteter, särskilt kardiotoxicitet kännetecknas av varierande symtom från asymtomatiska elektrokardiografiska förändringar till perikardit och dekompenserad kardiomyopati 1 , 2. hittills har minst tre stora hypoteser har framförts för att förklara DIC, inklusive aktiverat reaktivt syre arter (ROS)1,3,4,5, hämning av topoisomeras II-β ( TOP2β)6,7, och modulering av intracellulära kalcium release1,8,9. Ackumulerande bevis föreslår också genetiska anlag som en central riskfaktor för DIC10,11,12,13. Gen identiteter relaterade till dessa DIC anlag, kvarstår dock till stor del okända. Dexrazoxan är den enda adjuvant agent godkänd av oss Food and Drug Administration (FDA) att behandla DIC, men med begränsad genomförande14,15,16, vilket understryker behovet av att identifiera ytterligare terapeutiska strategier. Djurmodeller av DIC utforskas därför för dessa ändamål. På grund av deras tillgänglighet och enkelhet, mekanistiska studier på DIC modeller kan potentiellt ha bredare effekter på andra typer av kardiomyopatier: gemensam patogenes kan delas mellan kardiomyopatier av olika etiologier, särskilt på senare patologiska stadier17,18,19,20.

Förutom gnagare modeller av DIC, har zebrafiskar DIC modeller med högre genomströmning utvecklats för att underlätta upptäckten av nya genetiska faktorer såväl therapeutics. En embryonala DIC-modell har fastställts i genomskinliga zebrafiskar embryon för screening terapeutiska föreningar21. Med tanke på att kardiomyopatier är vuxen debut sjukdomar med en progressiv patogenes, utvecklat vuxen zebrafiskar kardiomyopati modeller har22,23,24,25,26. Vi skapade den första förvärvade modellen för kardiomyopati som följd av kronisk anemi24, följt av DIC som den andra förvärvade kardiomyopati modellen adult zebrafiskar23. Vi hittade att injektion av en engångsbolus av DOX i vuxen zebrafiskar inducerar kardiotoxicitet som består av en akut fas ungefär inom 1 vecka efter injektion (wpi), följt av en kronisk fas av kardiomyopati till 6 månader efter injektionen. Medan haploinsufficiency mekanistiska målet på rapamycin(mtor) ameliorates kardiomyopati vid kronisk fas, överdriver det fisk dödlighet på den akuta fasen, betonar värdet av vuxen DIC modellen att urskilja scenen-beroende mekanismer23. Vi visade vidare att den vuxna DIC-modellen kan användas att betona en samling av zebrafisk insertional hjärt (ZIC) mutanter som skapas via en transposon-baserade insertionsmutationer tillvägagångssätt27. En pilot skärm identifierade 3 kända kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, underfamilj B och medlemmen 6b (dnajb6b) som nya DIC känslighet gener28. Därför generationen av vuxen DIC modellen i zebrafiskar ledde till en ny metod som systematiskt möjliggör identifiering av genetiska modifierare för DIC, som kompletterar befintliga genome-wide association-studier (GWAS) och kvantitativa locus (QTL ) analys.

Under generering och genomförandet av modellen adult zebrafiskar DIC märkte vi betydande variationer mellan olika forskare och/eller även bland olika injektioner utförs av samma prövaren. Den längsgående naturen av modellen medför utmaningar att registrera resultat från olika undersökare och sekventiell felsökningsprocessen. För att underlätta användningen av denna enkla kardiomyopati-inducerande stress metod av gemenskapens forskning, vi beskriva våra protokoll i detalj, finns två typer av IP-injektion, och diskutera överväganden för att minska variationer mellan olika forskare.

Protocol

Alla förfaranden beskrivs här utfördes enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur (nationella akademier Press. 2011), och de godkändes av Mayo Clinic institutionella djur vård och användning kommittén. 1. vuxen zebrafiskar förberedelse Ställa in tillräckligt häckande par i crossing tankar att förvärva minst dubbelt så många som de totala fisk behövs DOX injektionsvätska. Om man jämför fisk med olika genetiska bakgrunder, odla alla fisk inom samma …

Representative Results

Här presenteras två metoder att utföra IP-injektion till modell DIC i vuxen zebrafiskar. När du använder den klassiska, etablerade IP-injektion metod29, noteras att den injicerade DOX lösningen (röd färg) ibland kunde sippra ut från den plats där nålen trängde. Alternativ IP-injektionen använder en annan plats för nål penetration som är 3-4 mm från bukhinnan där DOX släpps (figur 1A), som effektivt förhindrar läcka…

Discussion

För att modellera en progressiv DIC, bestämdes dosen 20 mg/kg DOX experimentellt som den högsta dos som inte orsakar betydande fisk dödsfall under 1 wpi men ändå resultat i fisk död och minskning av hjärtfunktion efter 4 wpi (figur 3 och Figur 4 c). Denna dos är jämförbara som ofta används i gnagare DIC modeller (15-25 mg/kg) och att den gräns kumulativa dosen för människor (550 mg/m2, vilket motsvarar 15 mg/kg)4</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds delvis av en vetenskapsman utveckling bidrag från American Heart Association (14SDG18160021 till YD), den amerikanska NIH R01 beviljar HL 81753 och HL 107304 till XX och XX Mayo stiftelsen.

Materials

Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle  WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy – putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
check_url/57567?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

View Video