בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר
Summary
שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.
Abstract
שורש העץ הגרעינים (DRG) מכילים תא גופות של נוירונים סנסוריים. סוג זה של נוירון הוא unipolar מדומים, עם שני אקסונים זה innervate רקמות היקפיים, כגון עור, שריר, איברים מהבטן, כמו גם הקרן בעמוד השדרה הגבי של מערכת העצבים המרכזית. החישה הניריונים לשדר תחושה הסומטית, כולל מגע, כאב, תחושות תרמי, נראה שההתפתחות שלהם. לכן, תרבויות העיקרי DRG נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים התאיים של nociception, פונקציות פיזיולוגיים של נוירונים סנסוריים, והתפתחות עצבית. ניתן ליישם את הנוירונים בתרבית מחקרים שכללו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, שחרור נוירוטרנסמיטר או סידן הדמיה. עם תרבויות העיקרי DRG, מדענים ייתכן תרבות הפומבית נוירונים DRG כדי לעקוב אחרי שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, התגברות על רבים מן המגבלות המשויך ויוו ניסויים. בהשוואה מסחרית זמינים שורות תאים DRG-ליפידים או מונצחים שורות תאים עצביים DRG, הרכב ואת המאפיינים של התאים הראשי דומים הרבה יותר החישה הניריונים ברקמות. עם זאת, בגלל מספר מוגבל של בתרבית תאים DRG הראשי ניתן לבודד מחיה יחיד, קשה לבצע מסכי תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. במאמר הנוכחי, מתוארים הליכים DRG אוסף ותרבות. בנוסף, נדגים את הטיפול בתרבית תאים DRG עם אגוניסט של neuropeptide FF קולטן מסוג 2 (NPFFR2) כדי לעודד את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים פפטיד (פפטיד הקשורות ג’ין קלציטונין (CRGP), חומר P (SP)).
Introduction
הגופות בתא החישה הניריונים נכללות DRG. נוירונים אלה unipolar מדומים, innervate רקמות היקפיים והן על מערכת העצבים המרכזית. קצות העצבים ההיקפיים של נוירונים סנסוריים מצויים שרירים, עור, איברים מהבטן, העצם, בין רקמות אחרות,. הן מעבירות תחושה היקפיים אותות עצבים סופים הקרן בעמוד השדרה הגבי, את האותות מועברים לאחר מכן אל המוח דרך מסלולים שונים בסדר עולה של תחושה סומאטית1,2. התחושה סומאטית מאפשר לגוף להרגיש (קרי, מגע, כאב, תחושות תרמי) וקולטים תנועה ו-1,מרחבית (תחושות נראה שההתפתחות שלהם)3. יש ארבע מחלקות של האקסונים מביא הראשי, כולל קבוצת אני הסיבים (Aα) להגיב קינסטזיה של שרירי השלד, סיבי II (Aβ) קבוצה מגיבים mechanoreceptors של העור, וקבץ השלישי (Aδ) וסיבים V (C) של קבוצה מגיבים לכאב, טמפרטורה. רק את סיבי C הם unmyelinated, ואילו השאר הם סיבי העצב על דרגות שונות.
Nociceptors הם נוירונים סנסוריים העיקרי, אשר מופעלים על ידי גירויים רעילים (גירוי מכני, תרמי, כימי) שנושאים פוטנציאל נזק לרקמות. נוירונים אלה מורכבים סיבי העצב סיבי Aδ ו- unmyelinated C סיבים1,4. הסיבים Aδ אקספרס קולטני גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי, קולטן trkA), CGRP של SP. סיבי C מסווגים peptidergic או אי-peptidergic סיבי C. מצד שני, סיבי C peptidergic שאינם מבטאים את קולטני neurotrophic גליה-derived factor (קולטנים GDNF, רט ו- GFR), isolectin IB4 של יונים ממותגת ATP ערוץ המשנה (P2X3)5,6,7. Nociceptors יכול להיות מכובד על-ידי הביטוי של תעלות יונים, מופעל על ידי גורמים neurotrophic, ציטוקינים, neuropeptides, ATP או כימיקלים אחרים תרכובות8. על גירוי, נוירוטרנסמיטרים, כולל CGRP, SP ו גלוטמט יכול להשתחרר מהתחנות נוירון חישה ב הצופר בעמוד השדרה הגבי לשדר אותות nociceptive2. DRG אינם רק המורכבת של נוירונים, אך גם להכיל לוויין גלייה. תאי לוויין להקיף את החישה הניריונים, מספקים תמיכה מכנית וחילוף9,10. מעניין, יש גוף גדל והולך של ראיות המצביעות על לוויין גלייה ב הרפובליקה עשויים להיות מעורבים בוויסות תחושה כאב11.
החישה הניריונים דווחו ביותר לעתים קרובות משמש ראשי תאים עצביים12 , כבר נעזרו אלקטרופיזיולוגיה, אותות, ומחקרים שחרור נוירוטרנסמיטר. הם גם משמשים כדי לחקור את המנגנונים התאיים של ההתפתחות העצבית, כאבים דלקתיים, כאב נוירופטי, תחושה בעור (כמו גירוד) האקסון תוצר12,13,14,15. להיות תרבותי תרבויות העיקרי DRG כמו נוירונים חלופה מועדפת כדי להעריך שינויים ביוכימיים יחיד או מספר תאים, מאפשרת למדענים לבצע מחקרים כי לא ניתן לבצע במקצועות ניסיוני. לאחרונה, DRG היו בהצלחה תרבותי של תורמי איברים אנושיים אשר ייתכן נהנים מאוד המחקר translational16. מצד שני, גם יכול להיות תרבותי החישה הניריונים כפי DRG explants. Explants DRG לשמר את הארכיטקטורה הרקמה המקורית של הנוירונים, לרבות תאי שוואן ותאי גלייה בלוויין, הן שימושיות במיוחד ללמוד אינטראקציות בין עצביים ותאי שאינם עצבית17. תרבויות העיקרי DRG ניתן להכין בקלות בתוך 2.5 h. תא הרכב ואת מאפייני הן מאוד רעיוני של מקור DRG, בתור שכזה, ניתן לאסוף DRG ספציפי (או בית החזה המותני DRG) בהתאם לדרישות ניסיוני. תרבויות של נוירונים DRG עובריים ו neonatal לדרוש גורם הגדילה העצבי לשרוד זירוז תוצר האקסון, אבל תרבויות של נוירונים בוגרים שאינם מצריכים התוספת של גורמים neurotrophic12,מדיה17. ישנם גם זמינים מסחרית שורות תאים DRG-ליפידים כגון ND7/23 והוא F11, שאינן דורשות השימוש של חיות ניסוי. עם זאת, העדר הקטיון פוטנציאליים קולטן ארעי ערוץ חבר תת V 1 (TRPV1) ביטוי (סמן חשוב עבור קטן החישה הניריונים nociceptive), ביטוי גנים incongruent פרופילים להגביל שלהם יישומים18. לאחרונה, מונצחים DRG עצביים תא קווים עיטורית שאבו עכברוש (50B11)19 ועכבר (MED17.11)20, אשר מתאימים עבור השתמש במסכים תפוקה גבוהה עבור סמים מיקוד מחקרים. עם זאת, ביטוי גנים פרופילים עבור שורות תאים אלה טרם שיש לבצע. כך, הניסויים אימות השוואת לתאי החישה הניריונים immortalized אלה הם עדיין בעיצומה.
NPFFR2 הוא מסונתז הרפובליקה, translocated אל המסופים העצבים החישה עמוד השדרה הגבי קרן21. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול culturing תאים DRG המותני ועיבוד אותם עם אגוניסט של NPFFR2 לזירוז בשחרור של נוירוטרנסמיטרים, CGRP ו- SP. התלות NPFFR2 נבדק עוד יותר באמצעות NPFFR2 קטן מפריעות RNA (siRNA), אשר עשוי להיות transfected לתוך התאים DRG בתרבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר הנוכחי, נדגים את האוסף, אנזים-דיסוציאציה והתרבות של עכברוש המותני DRG. עם תמיכה neurotrophic של גורם הגדילה העצבי, האקסונים של נוירונים DRG מורחב בתוך 3 ימים לאחר תא זריעה. האקסונים המורחבת היו בבירור הנצפה לאחר התאים היו מוכתם CGRP חלבון, אשר מסונתז בסומה תא והוא מועבר לאורך הסיבים האקסון. התהלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Calkins מ ר לצורך עריכה באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי צ’נג קונג לבית חולים (CMRPD1F0482), צ’נג קונג אוניברסיטת, המרכז לחקר הזדקנות בריאה (EMRPD1G0171), משרד המדע וטכנולוגיה (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
