신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화
Summary
지 루트 중추 (DRG) 주 문화 자주 생리 기능 또는 감각 신경에서 병리학 관련 이벤트를 공부 하는 데 사용 됩니다. 여기, 허리 DRG 문화 neuropeptide FF 수용 체 선택적 길 항 제와 함께 2 자극 입력 신경 전달 물질의 릴리스를 감지를 사용 하 여를 설명 합니다.
Abstract
지 루트 신경 절 (DRG) 포함 감각 뉴런의 셀 시체. 신경의이 유형은 의사는 유 니 폴라, 주변 조직, 피부, 근육, 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경의 척수 등 혼을 자극 하는 두 개의 축 삭과 이다. 감각 뉴런 체세포 센 세이 션, 터치, 고통, 열, 및 고유 감각을 포함 하 여 전송 합니다. 따라서, DRG 기본 문화 nociception의 셀룰러 메커니즘, 감각 신경, 신경 발달의 생리 기능 연구에 널리 사용 됩니다. 교양된 신경 생리학, 신호 변환, 신경 전달 물질 방출, 또는 칼슘 이미징 연구에 적용할 수 있습니다. DRG 기본 문화권, 과학자 들은 단일 생 화 학적 변화를 모니터링 끊된 DRG 뉴런 문화 수 있습니다 또는 vivo에서 실험과 관련 된 많은 한계를 극복 하는 여러 셀. 에 비해 상업적으로 사용 가능한 DRG hybridoma 세포 선 또는 불멸 하 게 DRG 신경 세포 선, 구성 및 1 차 셀의 속성은 감각 신경 조직에 훨씬 더 비슷합니다. 그러나, 하나의 동물에서 격리 될 수 있는 교양된 DRG 1 차 셀의 제한 된 수의 그것은 연구 대상으로 하는 약물에 대 한 높은 처리 화면을 수행 어렵다. 현재 문서에서 DRG 컬렉션 및 문화를 위한 절차를 설명 합니다. 또한, 우리 교양된 DRG 셀 neuropeptide FF 수용 체 타입-2의 주 작동 근 유도 펩타이드 신경 전달 물질 (칼 시 토 닌 유전자 관련 펩 티 드 (CRGP)와 물질 P (SP))의 릴리스 (NPFFR2)의 처리를 보여 줍니다.
Introduction
감각 뉴런의 셀 시체 DRG 안에 포함 되어 있습니다. 이러한 뉴런 의사 유 니 폴라 그리고 주변 조직 및 중앙 신경 시스템을 자극. 근육, 피부, 내장 기관, 뼈, 다른 조직. 중에서 발견 되는 감각 신경의 말 초 신경 엔딩 그들은 신경 척수 등 쪽 뿔과 신호에서 엔딩 다음 체세포 센 세이 션1,2의 다른 상승 통로 통해 두뇌에 전송 주변 감각 신호를 전송 합니다. 체세포 센 세이 션 (즉, 터치, 고통, 고 열 감각)을 인식 하는 움직임과 공간 방향 (고유 감각)1,3시체가 있습니다. 4가 있다 골격 근육, 피부, 몸의에 응답 하는 그룹 II (Aβ) 섬유의 proprioception 응답 그룹 III (Aδ) (Aα) 섬유 및 그룹 V (C) 고통에 응답 하는 등 기본 구심 축 삭의 서브 그룹 I 고 온도입니다. 나머지는 다른도로 myelinated만 C 섬유 myelinated, 하지 않습니다.
Nociceptors는 기본 감각 신경, 수행 조직 손상에 대 한 잠재적인 유해 자극 (기계적, 열, 및 화학 자극)에 의해 활성화 됩니다. 이러한 신경 myelinated Aδ 섬유 및 unmyelinated C 섬유1,4구성 됩니다. 신경 성장 인자 (NGF, trkA 수용 체), CGRP, 및 sp. 수용 체를 표현 하는 Aδ 섬유 C 섬유는 peptidergic 및 peptidergic가 아닌 C 섬유로 분류 됩니다. 다른 한편으로, 비 peptidergic C 섬유 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF, RET, 그리고 GFR 수용 체), isolectin IB4, 및 ATP 문을 단 이온 채널 하위 (P2X3)5,,67에 대 한 수용 체를 표현 한다. Nociceptors는 이온 채널의 식에 의해 구별 될 수 있으며 neurotrophic 요인에 의해 활성화, cytokines, neuropeptides, ATP, 또는 다른 화학 화합물8. 자극, 시 신경 전달 물질, 포함 CGRP, SP, 그리고 조미료 nociceptive 신호2전송 하 등 척추 경적에 감각 신경 터미널에서 해제 될 수 있습니다. DRG는 뉴런의 구성 뿐만 아니라 그러나 또한 위성 glial 세포를 포함. 위성 세포는 감각 뉴런을 둘러싸고 고 기계 및 대사 지원9,10를 제공 합니다. 흥미롭게도, 거기에 위성 glial 세포는 DRG에 통증 감각11조절에 관련 되어있을 수 있습니다 나타내는 증거의 성장 시체가입니다.
감각 뉴런 가장 자주 사용 하는 기본 신경 세포12 고 전기 생리학, 신호 변환, 및 신경 전달 물질 방출 연구 활용 보고 되었습니다. 그들은 또한 일반적으로 신경 개발, 염증 성 통증, neuropathic 고통, (같은 가려움증), 피부 감각 및 축 삭 가지12,13,,1415의 세포 메커니즘을 탐구 하는 데 사용 됩니다. DRG 기본 문화 실험 과목에서 수행할 수 없는 연구를 수행 하는 과학자를 수 있도록 단일 또는 여러 셀에 생 화 확 적인 변화를 평가 하기 위해 해리 뉴런으로 양식 수 있습니다. 최근, DRG 변환 연구16에 크게 혜택을 받을 수 있는 인간 장기 기증자에서 성공적으로 경작 했다. 다른 한편으로, 감각 신경으로 DRG explants 교양도 수 있습니다. DRG explants Schwann 세포 등 위성 glial 세포, 신경 세포의 원래 조직 아키텍처를 유지 하 고 특히 유용17신경 및 비 신경 세포 간의 상호 작용을 공부. DRG 주 문화는 2.5 h 이내 쉽게 준비 될 수 있습니다. 셀 구성 및 속성은 소스, DRG의 반사 고 등, 특정 DRG (요 추 또는 흉부 DRG) 실험 수요에 따라 수집 될 수 있습니다. 배아 및 신생아 DRG 뉴런의 문화 필요 NGF 생존과 축 삭 파생물을 유도 하지만 성인 뉴런의 문화 미디어12,17에 neurotrophic 요인의 추가 요구 하지 않습니다. 또한 상용 DRG hybridoma 세포 라인 ND7/23, F11, 실험 동물의 사용을 필요로 하지 않는 등이 있다. 그러나, 일시적인 수용 체 잠재력 양이온의 부족 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 식 (작은 감각 nociceptive 뉴런에 대 한 중요 한 표식) 및 부적당 유전자 식 프로필 제한18그들의 응용 프로그램. 최근, 라인 쥐 (50B11)19 에서 파생 된 DRG 신경 세포를 불멸 하 게 마우스 (MED17.11)20, 위해 적당 한에서 사용 높은 처리량 스크린 연구 대상으로 하는 약물에 대 한. 그러나, 유전자 발현 프로 파일링이 셀 라인을 아직 수행할 수 있다. 따라서, 감각 신경 세포를 불멸 하 게 세포를 비교 검증 실험은 여전히 진행 중입니다.
NPFFR2는 DRG에 합성 이며 척추 등 쪽 뿔21에 감각 신경 터미널 translocated. 이 문서에서 우리는 요 추 DRG 세포를 배양 하 고 신경 전달 물질, CGRP와 sp.의 분리를 유도 하는 NPFFR2의 길 항 제와 함께 그들을 치료에 대 한 프로토콜을 제공 NPFFR2에 대 한 의존 더 NPFFR2 작은 간섭 RNA (siRNA), 교양된 DRG 셀으로 페 수를 사용 하 여 테스트 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 문서에서 수집, 효소 분리 및 쥐 요 추의 문화 시연 DRG. NGF는 科 지원, DRG 뉴런의 축 삭 셀 시드 후 3 일 이내 연장. 확장된 축 삭 후 셀 셀 소마에서 합성 되 고 축 삭 섬유 따라 전송 CGRP 단백질에 대 한 스테인드 했다 명확 하 게 관찰 했다. 위성 세포 또한 확장을 일 이내 뉴런을 둘러싸고이 나누어 glial 세포를 허용 처리 합니다. 이 프로토콜에 의해 성장 주 DRG 세포는 감각 신경 조절 세포 메커?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 영어 편집 박사 M. Calkins 감사합니다. 이 작품은 장 궁 기념 병원 (CMRPD1F0482), 장 공 대학, 정상 노화 연구 센터 (EMRPD1G0171) 사역의 과학 및 기술 (105-2320-B-182-012-MY2)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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