पृष्ठीय रूट गैंग्लिया अलगाव और प्राथमिक संस्कृति न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई का अध्ययन करने के लिए
Summary
पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) प्राथमिक संस्कृतियों अक्सर शारीरिक कार्यों या विकृति संवेदी न्यूरॉन्स में संबंधित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. यहां, हम काठ का डीआरजी संस्कृतियों के उपयोग के लिए न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज के बाद neuropeptide एफएफ रिसेप्टर टाइप 2 एक चयनात्मक एगोनिस्ट के साथ उत्तेजना का पता लगाने के प्रदर्शन ।
Abstract
पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) संवेदी ंयूरॉंस के सेल निकायों होते हैं । इस प्रकार का ंयूरॉन है छद्म एकध्रुवीय, दो axons के साथ कि अंदर आना परिधीय ऊतकों, जैसे त्वचा, मांसपेशी और आंत अंगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की । संवेदी न्यूरॉन्स स्पर्श, दर्द, थर्मल, और proprioceptive उत्तेजना सहित दैहिक अनुभूति, संचारित । इसलिए, डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों व्यापक रूप से nociception के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, संवेदी न्यूरॉन्स के शारीरिक कार्य, और तंत्रिका विकास. प्रसंस्कृत ंयूरॉंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, संकेत transduction, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज, या कैल्शियम इमेजिंग शामिल अध्ययन में लागू किया जा सकता है । डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों के साथ, वैज्ञानिकों असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस संस्कृति को एकल या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन की निगरानी कर सकते हैं, vivo प्रयोगों में से जुड़ी सीमाओं के कई पर काबू पाने । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों या अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों की तुलना में, संरचना और प्राथमिक कोशिकाओं के गुणों के ऊतकों में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए बहुत अधिक समान हैं. हालांकि, एक ही जानवर से पृथक किया जा सकता है कि संस्कृतिपूर्ण डीआरजी प्राथमिक कोशिकाओं की सीमित संख्या के कारण, यह दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है. वर्तमान लेख में, डीआरजी संग्रह और संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, हम neuropeptide एफएफ रिसेप्टर प्रकार के एक एगोनिस्ट के साथ संस्कृतिपूर्ण डीआरजी कोशिकाओं के उपचार का प्रदर्शन 2 (NPFFR2) पेप्टाइड न्यूरोट्रांसमीटर (कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (CRGP) और पदार्थ पी (एसपी)) की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए.
Introduction
संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकायों डीआरजी के भीतर निहित हैं. इन न्यूरॉन्स छद्म एकध्रुवीय और अंदर आना दोनों परिधीय ऊतकों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र हैं । संवेदी न्यूरॉन्स की परिधीय तंत्रिका अंत मांसपेशियों में पाए जाते हैं, त्वचा, आंत अंगों, और अन्य ऊतकों के बीच हड्डी,. वे रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग में तंत्रिका अंत करने के लिए परिधीय अनुभूति संकेतों संचारित और संकेत तो दैहिक अनुभूति1,2के विभिंन आरोही रास्ते के माध्यम से मस्तिष्क को प्रेषित कर रहे हैं । दैहिक अनुभूति शरीर को महसूस करने के लिए सक्षम बनाता है (यानी, स्पर्श, दर्द, और थर्मल उत्तेजना) और अनुभव आंदोलन और स्थानिक उंमुखीकरण (proprioceptive अनुभूतियां)1,3। प्राथमिक afferent axons के चार उपवर्ग हैं जिनमें समूह I (Aα) तंतु शामिल हैं जो कंकाल की मांसपेशियों के proprioception का जवाब देते हैं, समूह द्वितीय (Aβ) तंतुओं कि त्वचा के mechanoreceptors का जवाब देते हैं, और समूह III (Aδ) और समूह V (ग) तंतुओं कि दर्द का जवाब और तापमान. केवल सी फाइबर unmyelinated होते हैं, जबकि बाकी विभिन्न डिग्री के myelinated होते हैं ।
Nociceptors प्राथमिक संवेदी ंयूरॉंस, जो हानिकारक उत्तेजनाओं (यांत्रिक, थर्मल, और रासायनिक उत्तेजना) कि ऊतक क्षति के लिए क्षमता ले द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । इन न्यूरॉन्स myelinated Aδ फाइबर और unmyelinated सी फाइबर से बना रहे हैं1,4. Aδ फाइबर तंत्रिका विकास कारक के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त (NGF, trkA रिसेप्टर), CGRP, और सपा. सी फाइबर या तो peptidergic और गैर peptidergic सी फाइबर के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । दूसरी ओर, गैर-peptidergic सी फाइबर glial के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त-व्युत्पंन neurotrophic कारक (GDNF, रेत, और GFR रिसेप्टर्स), isolectin IB4, और एटीपी-gated आयन चैनल उपप्रकार (P2X3)5,6,7. Nociceptors आयन चैनलों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है और neurotrophic कारकों, साइटोकिंस, neuropeptides, एटीपी, या अन्य रासायनिक यौगिकों8द्वारा सक्रिय. उत्तेजना पर, न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP सहित, सपा, और ग्लूटामेट संवेदी ंयूरॉन टर्मिनलों से स्पाइनल पृष्ठीय सींग में nociceptive संकेतों2संचारित करने के लिए जारी किया जा सकता है । डीआरजी न केवल ंयूरॉंस की रचना कर रहे हैं, लेकिन यह भी उपग्रह glial कोशिकाओं में शामिल हैं । सैटेलाइट कोशिकाओं संवेदी ंयूरॉंस चारों ओर और यांत्रिक और चयापचय का समर्थन9,10प्रदान करते हैं । दिलचस्प है, वहां सबूत के एक बढ़ती शरीर का संकेत है कि डीआरजी में उपग्रह glial कोशिकाओं दर्द सनसनी11विनियमन में शामिल किया जा सकता है ।
संवेदी ंयूरॉंस सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं को सूचित किया गया है12 और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयोग किया गया है, संकेत transduction, और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज अध्ययन. उंहोंने यह भी सामांयतः के लिए उपयोग किया जाता है सेलुलर तंत्र का पता लगाने के लिए ंयूरॉन विकास, भड़काऊ दर्द, neuropathic दर्द, त्वचा की अनुभूति (खुजली की तरह), और axon वृद्धि12,13,14,15। डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों असंबद्ध ंयूरॉंस के रूप में एक या एकाधिक कोशिकाओं में जैव रासायनिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए, वैज्ञानिकों को अध्ययन है कि प्रयोगात्मक विषयों में नहीं किया जा सकता प्रदर्शन करने की अनुमति के रूप में किया जा सकता है । हाल ही में, डीआरजी सफलतापूर्वक मानव अंग दाताओं जो काफी शोधों16लाभ हो सकता है से संस्कृति थे । दूसरी ओर, संवेदी न्यूरॉन्स को भी डीआरजी explants के रूप में कल्चरित किया जा सकता है. डीआरजी explants न्यूरॉन्स के मूल ऊतक वास्तुकला की रक्षा, Schwann कोशिकाओं और उपग्रह glial कोशिकाओं सहित, और विशेष रूप से न्यूरॉन्स और गैर-न्यूरॉन कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं17. डीआरजी प्राथमिक संस्कृतियों २.५ ज के भीतर आसानी से तैयार किया जा सकता है । कोशिका रचना और गुण स्रोत डीआरजी के अत्यधिक चिंतनशील होते हैं, और जैसे, विशिष्ट डीआरजी (काष्ठ या वक्ष डीआरजी) प्रयोगात्मक माँगों के अनुसार एकत्र किए जा सकते हैं । भ्रूण और नवजात डीआरजी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों NGF जीवित रहने के लिए और प्रेरित axon वृद्धि की आवश्यकता है, लेकिन वयस्क न्यूरॉन्स की संस्कृतियों मीडिया12,17करने के लिए neurotrophic कारकों के अलावा की आवश्यकता नहीं है. वहां भी कर रहे है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीआरजी-hybridoma सेल लाइनों जैसे ND7/23 और F11, जो प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार V सदस्य 1 की कमी (TRPV1) अभिव्यक्ति (छोटे संवेदी nociceptive न्यूरॉन्स के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर) और incongruent जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अपने आवेदन18सीमा. हाल ही में, अमर डीआरजी न्यूरॉन सेल लाइनों चूहे से व्युत्पंन किया गया है (50B11)19 और माउस (मेड 17.11)20, जो उच्च प्रवाह स्क्रीन में उपयोग के लिए दवा लक्ष्यीकरण अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । हालांकि, इन सेल लाइनों के लिए जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा अभी तक किया जा सकता है । इस प्रकार, सत्यापन संवेदी न्यूरॉन्स के लिए इन अमर कोशिकाओं की तुलना प्रयोगों अभी भी चल रहे हैं.
NPFFR2 डीआरजी में संश्लेषित और रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग21में संवेदी तंत्रिका टर्मिनलों को translocated है । इस लेख में, हम संवर्धन काठ का डीआरजी कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और उन्हें न्यूरोट्रांसमीटर, CGRP और एसपी की रिहाई के लिए प्रेरित करने के लिए NPFFR2 के एक एगोनिस्ट के साथ इलाज. NPFFR2 पर निर्भरता आगे NPFFR2 छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) का उपयोग कर परीक्षण किया है, जो कल्चरल डीआरजी कोशिकाओं में transfected हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान लेख में, हम संग्रह, एंजाइम-पृथक्करण, और चूहा काठ का डीआरजी की संस्कृति का प्रदर्शन । NGF से neurotrophic समर्थन के साथ, डीआरजी न्यूरॉन्स की axons सेल बोने के बाद 3 दिनों के भीतर विस्तारित. विस्तारित axons स्पष्ट रू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अंग्रेजी संपादन के लिए डॉ एम Calkins धंयवाद । इस काम चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPD1F0482), चांग गुंग विश्वविद्यालय, स्वस्थ एजिंग अनुसंधान केंद्र (EMRPD1G0171) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2320-B-182-012-MY2) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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