Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren
Summary
Dorsal Root Ganglien (DRG) Primärkulturen werden häufig verwendet, um physiologische Funktionen oder Pathologie-Veranstaltungen in sensorischen Neuronen zu studieren. Hier zeigen wir den Einsatz von lumbalen DRG-Kulturen, die Freisetzung von Neurotransmittern zu erkennen, nachdem Neuropeptid FF-Rezeptor Typ 2 Stimulation mit ein selektiver Agonist.
Abstract
Dorsal Root Ganglien (DRG) enthalten Zellkörper der sensorischen Neuronen. Diese Art des Neurons ist Pseudo-unipolar, mit zwei Axone, die periphere Geweben wie Haut, Muskeln und viszeralen Organe sowie die Wirbelsäule Hinterhorn des zentralen Nervensystems innervieren. Sensorische Neuronen vermitteln somatische Gefühl, einschließlich Touch, Schmerzen, thermische und propriozeptive Empfindungen. Daher sind DRG Primärkulturen verbreitet, die zellulären Mechanismen der nozizeption, physiologische Funktionen des sensorischen Neuronen und neurale Entwicklung zu studieren. Die kultivierten Neuronen können in Studien mit Elektrophysiologie, Signaltransduktion, Neurotransmitter-Freisetzung oder Kalzium Imaging angewendet werden. Mit DRG Primärkulturen Wissenschaftler können dissoziierte DRG-Neuronen zur Überwachung der biochemischer Veränderungen in einzelnen Kultur oder mehrere Zellen, die viele der Einschränkungen zu überwinden in Vivo Experimente zugeordnet. Im Vergleich zu kommerziell sind verfügbar DRG-Hybridom-Zell-Linien oder verewigt DRG neuronalen Zelllinien, die Zusammensetzung und Eigenschaften von den Primärzellen sensorischen Neuronen im Gewebe viel ähnlicher. Aufgrund der begrenzten Anzahl von kultivierten DRG-Primärzellen, die von einem einzigen Tier isoliert werden können, ist es jedoch schwierig, Hochdurchsatz-Bildschirme für Drug targeting Studien durchführen. In dem aktuellen Artikel werden Verfahren für die DRG-Sammlung und Kultur beschrieben. Darüber hinaus zeigen wir Ihnen die Behandlung von kultivierten DRG Zellen mit Agonist Neuropeptid FF Rezeptor Typ 2 (NPFFR2), die Freisetzung von Neurotransmittern Peptid (Calcitonin-gen-related Peptid (CRGP) und Substanz P (SP)) zu induzieren.
Introduction
Die Zellkörper der sensorischen Neuronen sind in DRG enthalten. Diese Neuronen sind Pseudo-unipolar und innervieren peripheren Geweben und das zentrale Nervensystem. Die peripheren Nervenenden der sensorischen Neuronen finden sich in Muskeln, Haut, viszeralen Organe und Knochen, unter anderen Geweben. Sie Strahlen peripheren Empfindung Signale zu Nerven, die Endungen in der Wirbelsäule Hinterhorn und die Signale dann an das Gehirn über verschiedene aufsteigende Wege von somatischen Sensation1,2übertragen werden. Somatische Empfindung ermöglicht dem Körper zu fühlen (d.h., Berührungs-, Schmerz-, und thermische Empfindungen) und Bewegung und räumliche Orientierung (propriozeptive Empfindungen)1,3wahrnehmen. Es gibt vier Unterklassen der primären afferenten Axone, einschließlich der Gruppe I (Aα) Fasern, die Propriozeption der Skelettmuskulatur, Gruppe II (Aβ) Fasern, die Beantwortung von Mechanorezeptoren der Haut reagieren und Gruppe III (Aδ) und Gruppe V (C) Fasern, die auf Schmerzen reagieren und Temperatur. Nur die C-Fasern sind unmyelinierten, während der Rest sind Markhaltige in unterschiedlichem Ausmaß.
Nozizeptoren sind die primären sensorischen Neuronen, die durch Schmerzreize (mechanische, thermische und chemische Stimulation) aktiviert werden, das Potenzial für Gewebeschäden führen. Diese Neuronen bestehen aus Markhaltige Aδ-Fasern und unmyelinierten C Fasern1,4. Die Aδ-Fasern zum Ausdruck bringen, der Rezeptoren für den Nervenwachstumsfaktor (NGF, TrkA Rezeptor), CGRP und SP. Die C-Fasern sind entweder Peptidergic und nicht Peptidergic C-Fasern eingestuft. Auf der anderen Seite der nicht-Peptidergic-C-Fasern zum Ausdruck bringen der Rezeptoren für Glia-derived Neurotrophic Factor (GDNF, RET und GFR-Rezeptoren), Isolectin IB4 und ATP-gated Ion Channel Subtyp (P2X3)5,6,7. Nozizeptoren können zeichnet sich durch den Ausdruck von Ionenkanälen und durch neurotrophe Faktoren aktiviert, Zytokine, Neuropeptide, ATP oder andere chemische Verbindungen8. Nach Stimulation können Neurotransmitter, darunter CGRP, SP und Glutamat von sensorischen Neuron-Terminals in der Wirbelsäule Hinterhorn nozizeptiven Signale2übertragen entbunden werden. DRG bestehen nicht nur aus Neuronen, aber auch Satelliten Glia-Zellen enthalten. Satellitenzellen umgeben die sensorischen Neuronen und bieten mechanische und metabolische Unterstützung9,10. Interessanterweise gibt es eine wachsende Zahl von beweisen, die darauf hinweist, dass Sat-Gliazellen im DRG beteiligt sein können, bei der Regulierung der Schmerz Empfindung11.
Sensorische Neuronen wurden gemeldet, die am häufigsten verwendeten primären Nervenzellen12 und haben für Elektrophysiologie, Signaltransduktion und Neurotransmitter-Freisetzung Studien verwendet worden sein. Sie dienen häufig auch die zellulären Mechanismen der neuronalen Entwicklung, entzündliche Schmerzen, neuropathische Schmerzen, Hautgefühl (z. B. Juckreiz) und Axon Auswuchs12,13,14,15zu erkunden. DRG Primärkulturen können kultiviert werden, als dissoziierte Neuronen zu beurteilen, biochemische Veränderungen in einzelne oder mehrere Zellen, so dass Wissenschaftler, Studien durchzuführen, die in Versuchspersonen durchgeführt werden kann. Vor kurzem, DRG wurden erfolgreich kultiviert aus menschlichen Organspendern die translationale Forschung16profitieren könnte. Auf der anderen Seite können die sensorische Neuronen auch kultiviert werden wie DRG explants. Die DRG-Explantaten bewahren die ursprüngliche Gewebearchitektur der Neuronen, einschließlich Schwann-Zellen und Gliazellen Satelliten, und sind besonders nützlich, um Interaktionen zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen17zu untersuchen. DRG Primärkulturen können leicht innerhalb von 2,5 Stunden hergestellt werden. Die Zelle Zusammensetzung und Eigenschaften sind stark reflektierende der Quelle DRG, und als solche kann spezifische DRG (Lenden- oder Brustwirbelsäule DRG) gesammelt werden, nach experimentellen Anforderungen. Kulturen der embryonalen und neonatale DRG-Neuronen erfordern NGF zu überleben und Axon Auswuchs zu induzieren, aber Kulturen von Erwachsenen Nervenzellen benötigen keine Zugabe von neurotrophen Faktoren, die die Medien12,17. Außerdem gibt es im Handel erhältliche DRG-Hybridom-Zell-Linien wie SD7/23 und F11, die nicht den Einsatz von Versuchstieren erfordern. Jedoch der Mangel an der transienten Rezeptor potenzielle kation Kanal Unterfamilie V Mitglied 1 (TRPV1) Ausdruck (ein wichtiger Marker für kleine sensorischen nozizeptiven Neuronen) und inkongruente gen expressionsprofile begrenzen ihre Anwendungen18. Vor kurzem verwenden verewigt DRG neuronale Zelle, die Ratte (50B11)19 Linien abgeleitet worden und Maus (MED17.11)20, die geeignet sind für Drug targeting Studien im Hochdurchsatz-Bildschirme. Gen-Expression profiling für diesen Zelllinien muss jedoch noch durchgeführt werden. Somit sind die Validierung Experimente vergleicht diese verewigt Zellen zu sensorischen Neuronen noch nicht abgeschlossen.
NPFFR2 ist in der DRG synthetisiert und an den Klemmen sensorische Nerven in der Wirbelsäule Hinterhorn21umgesiedelt. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll für Lendenwirbelsäule DRG-Zellen kultiviert und Behandlung mit Agonist NPFFR2 induzieren die Freisetzung von Neurotransmittern, CGRP und SP. Die Abhängigkeit von NPFFR2 wird weiter getestet, mit NPFFR2 kleinen interferierende RNA (SiRNA), die in kultivierten Zellen DRG transfiziert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel zeigen wir die Sammlung, Enzym-Dissoziation und Kultur der Ratte Lenden DRG. Mit der neurotrophe Unterstützung von NGF erweitert die Axone der DRG-Neuronen innerhalb von 3 Tagen nach der Aussaat der Zelle. Die erweiterte Axone waren eindeutig beobachtbaren, nachdem Zellen für CGRP Protein, gebeizt wurden die in der Zelle Soma synthetisiert und entlang den Axon Fasern transportiert. Die Prozesse der satellitenzellen auch erweitert, so dass diese teilenden Gliazellen umgeben die Neurone innerhalb von Ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. M. Calkins für englische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) und Ministerium für Wissenschaft und Technologie (105-2320-B-182-012-MY2) unterstützt.
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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