Dorsalrotsganglier ganglier isolering och primära kultur att studera neurotransmitterfrigöraren
Summary
Dorsalrotsganglier ganglier (DRG) primära kulturer används ofta att studera fysiologiska funktioner eller patologi-relaterade händelser i sensoriska nervceller. Här visar vi användningen av ryggradens DRG kulturer att identifiera frisättningen av signalsubstanser efter neuropeptid FF receptorn typ 2 stimulering med en selektiv agonist.
Abstract
Dorsalrotsganglier (DRG) innehåller cellen organ sensoriska nervceller. Denna typ av neuron är pseudo unipolär, med två axoner som innerverar perifera vävnader, såsom hud, muskler och viscerala organ, samt spinal dorsala hornen av centrala nervsystemet. Sensoriska nervceller överföra somatisk sensation, inklusive beröring, smärta, termisk och proprioceptiva förnimmelser. DRG primära kulturer används därför allmänt att studera cellulära mekanismer för nociception, fysiologiska funktioner sensoriska nervceller och neural utveckling. De odlade nervcellerna kan tillämpas i studier elektrofysiologi, signaltransduktion, neurotransmitterfrigöraren eller kalcium imaging. Med DRG primära kulturer, forskare kan kultur dissocierade DRG nervceller för att övervaka biokemiska förändringar i singel eller flera celler, att övervinna många av begränsningarna som är associerade med in-vivo -experiment. Jämfört med kommersiellt är tillgängliga DRG-hybridoma cellinjer eller förevigade DRG neuronala cellinjer, sammansättning och egenskaper hos de primära cellerna mycket mer liknar sensoriska nervceller i vävnad. På grund av det begränsade antalet odlade DRG primära celler som kan isoleras från ett enskilt djur, är det dock svårt att utföra hög genomströmning skärmar för läkemedel inriktade studier. I nuvarande artikel beskrivs förfaranden för DRG samling och kultur. Dessutom visar vi behandling av odlade DRG celler med en agonist av neuropeptid FF receptorn typ 2 (NPFFR2) för att inducera frisättning av peptid signalsubstanser (kalcitonin gene-relaterad peptid (CRGP) och substans P (SP)).
Introduction
De cellen organ sensoriska nervceller som ingår i DRG. Dessa nervceller är pseudo unipolär och innerverar både perifera vävnader och centrala nervsystemet. Perifera nervändar av sensoriska nervceller finns i muskler, hud, viscerala organ och ben, bland andra vävnader. De sänder perifera sensation signaler till nerv ändelser i spinal dorsala hornen och signaler som sedan överförs till hjärnan via olika stigande vägar av somatisk sensation1,2. Somatisk sensation gör att kroppen att känna (dvs, beröring, smärta och termisk förnimmelser) och uppfattar rörelse och rumslig orientering (proprioceptiva förnimmelser)1,3. Det finns fyra underklasser av primära afferenta axoner, inklusive grupp I (Aα) fibrer som svarar på proprioception av skelettmuskulaturen, grupp II (Aβ) fibrer som svarar på mekanoreceptorer i huden, och grupp III (Aδ) och grupp V C fibrer som reagerar på smärta och temperatur. Endast de C-fibrerna är unmyelinated, medan resten är myeliniserade till olika grader.
Nociceptorer är primära sensoriska nervceller, som aktiveras av skadliga stimuli (mekanisk, termisk och kemisk stimulering) som bär risken för vävnadsskada. Dessa nervceller består av myeliniserade Aδ-fibrer och unmyelinated C fibrer1,4. Den Aδ-fibrer express receptorerna för nervtillväxtfaktor (NGF, trkA receptor), CGRP och SP. De C-fibrerna klassificeras som antingen peptiderga och icke-peptiderga C-fibrer. Däremot, express de icke-peptiderga C-fibrerna receptorerna för gliaceller neurotrofa faktorn (GFR GDNF och RET-receptorer), isolectin IB4 och ATP-gated ion kanal subtyp (P2X3)5,6,7. Nociceptorer kan kännetecknas av uttrycket av jonkanaler och aktiveras av neurotrofa faktorer, cytokiner, neuropeptider, ATP eller andra kemiska föreningar8. Vid stimulering befrias signalsubstanser, inklusive CGRP, SP och glutamat från sensoriska neuron terminaler i spinal dorsala horn överföra nociceptiva signaler2. DRG är inte bara består av nervceller, men också innehåller satellit gliaceller. Satellit celler omger sensoriska nervceller och ge support för mekaniska och metabola9,10. Intressant, finns det en växande mängd bevis som visar att satellit gliaceller i DRG kan vara inblandade i regleringen av smärta sensation11.
Sensoriska nervceller har rapporterats vara mest ofta Använd primära neuronala celler12 och har utnyttjats för elektrofysiologi, signaltransduktion och signalsubstansen release studier. De används också ofta att utforska de cellulära mekanismerna av neuronal utveckling, inflammatorisk smärta, neuropatisk smärta, känsla i huden (som kliar) och axon utväxt12,13,14,15. DRG primära kulturer kan vara odlade som dissocierade nervceller att bedöma biokemiska förändringar i en eller flera celler, så att forskare att utföra studier som inte kan utföras i experimentella ämnen. Nyligen, DRG odlades framgångsrikt från mänskliga organdonatorer som kraftigt skulle gynna translationell forskning16. Däremot, kan sensoriska nervceller också vara odlade som DRG explants. De DRG bladsticklingar bevara den ursprungliga vävnad arkitekturen av nervceller, inklusive Schwann celler och satellit gliaceller, och är särskilt användbara för att studera interaktioner mellan neuronala och icke-neuronala celler17. DRG primära kulturer kan förberedas enkelt inom 2,5 h. Cell sammansättning och egenskaper är starkt reflekterande av källan DRG, och som sådan, specifika DRG (ländryggen eller bröstkorg DRG) kan samlas in enligt experimentella krav. Kulturer av embryonala och neonatal DRG nervceller kräver NGF att överleva och framkalla axon utväxt, men kulturer av vuxen nervceller kräver inte tillsats av neurotrofa faktorer till media12,17. Det finns också kommersiellt tillgängliga DRG-hybridoma cellinjer som ND7/23 och F11, som inte kräver användning av försöksdjur. Men avsaknaden av transient receptor potential cationen kanal underfamilj V medlem 1 (TRPV1) uttryck (en viktig markör för små sensoriska nociceptiva neuroner) och inkongruenta gen uttryck profiler begränsa deras program18. Nyligen, förevigade DRG neuronala cell linjer har hämtats från råtta (50B11)19 och mus (MED17.11)20, som är lämpliga för användning i hög genomströmning skärmar för läkemedel inriktade studier. Genuttryck profilering för dessa cellinjer har emellertid ännu som ska utföras. Således pågår de validering experiment jämföra dessa förevigade celler till sensoriska nervceller fortfarande.
NPFFR2 syntetiseras i DRG och flyttad till sensoriska nerver terminaler i spinal dorsala horn21. I denna artikel ger vi ett protokoll för odling ländryggen DRG celler och behandla dem med en agonist av NPFFR2 att inducera frisättning av signalsubstanser, CGRP och SP. Beroendet av NPFFR2 ytterligare provas med NPFFR2 små störande RNA (siRNA), som kan vara transfekterade till de odlade DRG-cellerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel, vi visar insamling, enzym-dissociation och kultur av råtta ländryggen DRG. Med neurotrofa stöd från NGF extended axoner av nervceller som DRG inom 3 dagar efter cell sådd. Den utöka axoner var tydligt observerbara efter celler var målat för CGRP protein, som syntetiseras i den cellen soma och transporteras längs axonet fibrerna. Processerna för satellit celler också utvidgas, så att dessa avdelande gliaceller att omge nervceller inom dagar. De primära DRG-celler som odlas av detta protokoll …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. M. Calkins för engelska redigering. Detta arbete stöddes av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung universitetet, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) och ministeriet för vetenskap och teknik (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
