Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore
Summary
Colture primarie di radice dorsale (DRG) i gangli sono frequentemente utilizzati per studiare funzioni fisiologiche o eventi relativi alla patologia nei neuroni sensoriali. Qui, noi dimostrare l’uso di colture di DRG lombare per rilevare il rilascio dei neurotrasmettitori dopo tipo del ricevitore di neuropeptide FF 2 stimolazione con un agonista selettivo.
Abstract
Gangli delle radici dorsali (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali. Questo tipo di neurone è pseudo-unipolare, con due assoni che innervano tessuti periferici, quali pelle, muscolo e organi viscerali, come pure il corno dorsale spinale del sistema nervoso centrale. Neuroni sensoriali trasmettono sensazione somatica, tra cui touch, dolore, sensazioni termiche e propriocettivi. Di conseguenza, colture primarie di DRG sono ampiamente usati per studiare i meccanismi cellulari della nocicezione, funzioni fisiologiche dei neuroni sensoriali e lo sviluppo neurale. I neuroni in coltura possono essere applicati negli studi di elettrofisiologia, trasduzione del segnale, rilascio di neurotrasmettitori o l’imaging del calcio. Con colture primarie di DRG, gli scienziati possono coltura neuroni DRG dissociati per monitorare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, superando molti dei limiti connessi con esperimenti in vivo . Rispetto al commercialmente disponibili linee di cellule di ibridoma DRG o immortalizzate linee neuronali DRG, composizione e le proprietà delle cellule primarie sono molto più simili ai neuroni sensoriali nel tessuto. Tuttavia, a causa del numero limitato di cellule coltivate primarie DRG che possono essere isolate da un singolo animale, è difficile effettuare gli schermi ad alta produttività per droga studi di targeting. Nell’articolo attuale, sono descritte le procedure per la raccolta di DRG e cultura. Inoltre, dimostriamo che il trattamento delle cellule coltivate di DRG con un agonista del recettore di neuropeptide FF tipo 2 (NPFFR2) per indurre il rilascio di neurotrasmettitori del peptide (peptide correlato al gene della calcitonina (CRGP) e sostanza P (SP)).
Introduction
I corpi cellulari dei neuroni sensoriali sono contenuti all’interno di DRG. Questi neuroni sono pseudo-unipolari e innervano sia tessuti periferici e del sistema nervoso centrale. Le terminazioni del nervo periferico dei neuroni sensoriali si trovano nel muscolo, pelle, organi viscerali e osso, tra altri tessuti. Trasmettono segnali periferici sensazione al nervo terminazioni nel corno dorsale spinale e i segnali vengono poi trasmessi al cervello attraverso differenti vie ascendenti di sensazione somatica1,2. Sensazione somatica permette al corpo di sentire (cioè, touch, dolore e sensazioni termiche) e percepire il movimento e orientamento spaziale (sensazioni propriocettive)1,3. Ci sono quattro sottoclassi degli assoni afferenti primari, tra cui gruppo I (Aα) fibre che rispondono a propriocezione dei muscoli scheletrici, le fibre di gruppo II (Aβ) che rispondono a meccanorecettori della pelle, e gruppo III (Aδ) e le fibre di gruppo V (C) rispondere al dolore e temperatura. Solo le fibre C sono unmyelinated, mentre il resto sono myelinated ai gradi differenti.
Nocicettori sono neuroni sensitivi primari, che vengono attivati da stimoli nocivi (stimolazione meccanica, termica e chimica) che portano il potenziale di danno tissutale. Questi neuroni sono composti da fibre Aδ myelinated e1,unmyelinated fibre di C4. Le fibre Aδ esprimono i recettori per il fattore di crescita nervoso (NGF, recettore trkA), CGRP e SP. Le fibre C sono classificate come peptidergic sia non-peptidergic fibre C. D’altra parte, le fibre C non peptidergic esprimono i recettori per il fattore neurotrophic glial-derivato (recettori GDNF, RET e GFR), isolectin IB4 e ionici ATP canale sottotipo (P2X3)5,6,7. Nocicettori possono essere distinto dall’espressione di canali ionici e attivati da fattori neurotrofici, citochine, neuropeptidi, ATP o altro prodotto chimico composti8. Stimolazione, neurotrasmettitori, tra cui CGRP, SP e glutammato possono essere liberati dai terminali di neurone sensoriale nel corno dorsale spinale per trasmettere segnali nocicettivi2. DRG non solo sono composti da neuroni, ma contengono anche cellule gliali satellitare. Le cellule satelliti circondano i neuroni sensoriali e forniscono supporto meccanico e metabolico9,10. Interessante, ci è un corpo crescente di prova che indica che cellule glial satelliti in DRG possono essere coinvolto nella regolazione della sensazione di dolore11.
I neuroni sensoriali sono stati segnalati per essere il più frequentemente usato cellule neuronali primarie12 e è stato utilizzato per elettrofisiologia, trasduzione del segnale e gli studi di rilascio di neurotrasmettitore. Essi sono anche comunemente utilizzati per esplorare i meccanismi cellulari di sviluppo neuronale, dolore infiammatorio, dolore neuropatico, sensazione di pelle (come prurito) e assone escrescenza12,13,14,15. Colture primarie di DRG possono essere coltivati come neuroni dissociati per valutare i cambiamenti biochimici nella singola o più celle, permettendo agli scienziati di eseguire studi che non possono essere eseguiti in soggetti sperimentali. Recentemente, DRG sono state coltivate con successo dai donatori di organo umano che potrebbero beneficiare notevolmente ricerca traslazionale16. D’altra parte, i neuroni sensoriali possono essere coltivati anche come DRG espianti. Gli espianti DRG preservano l’architettura originale del tessuto dei neuroni, tra cui le cellule di Schwann e cellule gliali satellitare e sono particolarmente utili per studiare le interazioni tra cellule neuronali e non neuronali17. Colture primarie di DRG possono essere facilmente preparati all’interno di 2,5 h. La composizione delle cellule e le proprietà sono altamente riflettente dell’origine DRG, e come tale, DRG specifici (DRG lombare o toracica) possono essere raccolti secondo esigenze sperimentali. Colture di neuroni DRG embrionali e neonatali richiedono NGF sopravvivere e per indurre la crescita assonale, ma colture di neuroni adulti non richiedono l’aggiunta di fattori neurotrofici al media12,17. Ci sono anche linee di cellulari DRG-ibridoma commercialmente disponibili come CD7/23 e F11, che non richiedono l’uso di animali da esperimento. Tuttavia, la mancanza del catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 1 (TRPV1) espressione (un indicatore importante per piccoli neuroni sensoriali nocicettivi) e profili di espressione genica incongruenti limitano loro applicazioni18. Recentemente, cellulare di un neurone di DRG immortalata linee sono state derivate dal ratto (50B11)19 e del mouse (MED17.11)20, che sono adatti per uso in schermi di alto-rendimento per droga studi di targeting. Tuttavia, profili di espressione genica per queste linee cellulari ha ancora da eseguire. Così, gli esperimenti di convalida confrontando queste cellule immortalizzate ai neuroni sensoriali sono ancora in corso.
NPFFR2 viene sintetizzata in DRG e traslocata ai terminali del nervo sensoriale nel corno dorsale spinale21. In questo articolo, forniamo un protocollo per la coltura delle cellule DRG lombare e trattarli con un agonista di NPFFR2 per indurre il rilascio di neurotrasmettitori, CGRP e SP. La dipendenza da NPFFR2 è ulteriormente testato utilizzando NPFFR2 Short interfering RNA (siRNA), che può essere transfected nelle cellule coltivate del DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente articolo, dimostriamo la collezione, enzima-dissociazione e la cultura di lombare ratto DRG. Con il supporto di neurotrophic da NGF, gli assoni dei neuroni DRG esteso entro 3 giorni dopo la semina delle cellule. Gli assoni estesi erano chiaramente osservabili dopo che le cellule sono state macchiate per proteina CGRP, che è sintetizzata nel soma cellulare e trasportata lungo le fibre dell’assone. I processi delle cellule satelliti anche estese, permettendo queste cellule gliale divisione a circondare i neur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. M. Calkins per l’editing di inglese. Questo lavoro è stato supportato da Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) e Ministero della scienza e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
