العميق "الجلد حقن كنموذج" "عدوى الجلد" المبيضات البيض "التحليل النسيجي"
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول يسمح للتحليل النسيجي والجزيئية لعينات الجلد بعد الحقن داخل الأدمة المبيضات البيض . هذا البروتوكول يحافظ على السلامة الهيكلية للجلد ويسمح بإضفاء الطابع المحلي على الخلايا المناعية المقيم في الأنسجة أو المعينين حديثا، فضلا عن توزيع الممرض.
Abstract
الجلد هيئة موسعة جداً للجسم، وسبب هذا السطح كبيرة، يتعرض باستمرار للكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تلف الجلد بسهولة للإصابة بالعدوى في الأدمة مما يؤدي بدوره إلى نشر مسببات الأمراض إلى مجرى الدم. فهم كيف يحارب الجهاز المناعي العدوى في مرحلة مبكرة جداً، وكيف المضيف يمكن القضاء على مسببات الأمراض خطوة هامة لتعيين القاعدة للتدخلات العلاجية في المستقبل. هنا يصف لنا نموذجا لعدوى المبيضات البيض التي يمكن تصور العمليات التي تحدث مبكرا أثناء عدوى، بما في ذلك عند الممرض اجتاز الحاجز الظهارية، فضلا عن الاستجابة المناعية وأثارت قبل المبيضة الغزو. استخدمنا هذا النموذج الإصابة لإجراء تحاليل نسيجية تظهر الخلايا المناعية التي اختراق الجلد، فضلا عن وجود وإضفاء الطابع المحلي على مسببات المرض. جمع عينات بعد العدوى يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي.
Introduction
جسم الإنسان مغطى عددا كبيرا جداً من الكائنات الحية الدقيقة. سطح الجلد هو موئل البكتيريا تقريبا 1 مليون كل سنتيمتر مربع1. ومع ذلك، لا يعكس هذا العدد، مجموعة كاملة من الكائنات المجهرية التي كولونيزيس الجلد. بالإضافة إلى البكتيريا، هو جسم الإنسان استعمر العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك المبيضة، التي قادرة على البقاء على قيد الحياة في الأغشية المخاطية و الجلد المستوى2على حد سواء.
في السنوات الأخيرة، زادت النسبة المئوية للمصابين بالأمراض الفطرية هائلا. وهذا يرجع أساسا إلى ارتفاع عدد الأشخاص المناعة، أي، مرضى فيروس نقص المناعة البشرية والمرضى التي مرت بالعلاج الكيماوي أو الأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع3. وفي مراقبة دراسة أجريت في الولايات المتحدة، أظهر ويسبلينغوف et al. أن 9.5% التهابات مجرى الدم في المستشفيات سببها المبيضات الأنواع4. بسبب زيادة حدوث الأمراض الفطرية، ولا سيما بسبب النسبة المئوية المرتفعة من المبيضات الأنواع التي تم العثور عليها أثناء التهابات مجرى الدم، فهم كيف يهرب هذا الممرض عنصر التحكم في الجهاز المناعي الغاية الهام.
المبيضة هو فطر ديمبرافيك الذي ينمو في مختلف الأشكال المورفولوجية مثل الخميرة، بلاستوسبوريس، بسيودوهيفاي، وخيوط فطرية تبعاً للظروف البيئية5. في شكله أصله، يظهر قدرته اختزاع أعلى المبيضة ولديه القدرة على اختراق ظهارة6.
وقد درست التهابات المبيضة باستخدام العديد من الطرق التجريبية. النموذج الأكثر شيوعاً للإصابة هو الحقن الوريدي من خميرة المبيضة 7. ومع ذلك، هذا النموذج لا تراعي جميع العمليات التي يحدث قبل تمكن الفطريات تنتشر في مجرى الدم. نموذج آخر يستفيد من قدرة المبيضة على غزو الظهارة. هذا الأسلوب، المعروف أيضا الرمل ورقة النموذجي8، وقد وضعته جاسبارى et al. في عام 19989، ويتكون من استخدام ورق الرمل كشط الجلد، وبالتالي القضاء على الطبقة القرنية قبل تطبيق المبيضة. يسمح هذا الإجراء الفطريات لاختراق الظهارة، مما يتيح تحليل قدرات الغازية من مسببات هذا المرض. وأخيراً، قد استخدمت نماذج أخرى من الالتهابات المعوية10 والمسالك التنفسية11 في دراسات مختلفة.
تشكيل الجرح (كما هو الحال في نموذج ورقة الرمال) يؤدي تفعيل مسارات عدة، بما في ذلك تجنيد الخلايا المناعية والتنشيط، بغية تعزيز عملية الشفاء12. هذا يمكن تغيير أو قناع الاستجابة المناعية تحديداً أثارت ضد مسببات المرض، مما يؤدي إلى التباس النتائج.
هنا يصف لنا طريقة العدوى الجلدية التي تتجنب الجرح الأولى تشكيل وتنظيم دورات تعريفية لبيئة تحريضية القاعدية. للحفاظ على هيكل الظهارية سليمة، مباشرة حقن المبيضة في شكله أصله في ديرما العميق. على الرغم من أن حقنه واحدة يمكن أن تثير التهاب معتدل، مقدار التهاب محدودة ومقيدة بالمقارنة إلى تشكيل جرحا مفتوحاً كما هو الحال في نموذج ورقة الرمل. أن النهج الذي يصف لنا هنا يتيح دراسة الاستجابة المناعية الفطرية وانتشار مع تجنب البيئة التحريضية المفرطة والموجودة من قبل بسبب الأضرار الميكانيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يمكننا وصف أسلوب الإصابة المبيضة لدراسة عملية التحريضية التي يتم تهيئتها عند مدخل الفطرية في ديرما العميق.
على الرغم من أن تكوين خراج الجلد حدث نادر نسبيا عند الإصابة المبيضة 15، حقن الفطر مباشرة في ديرما عميق يسمح ليس فقط دراسة تشكيل الخراج يحركه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG تدعمه الإيطالية رابطة كل سول ريشيركا la كانكرو (IG 2016Id.18842) ومؤسسة كاريبلو (منحة 2014-0655) ومؤسسة الإقليمي الواحد la ريشيركا بيوميديكا (التثبت).
عز معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01AI121066-01A1، 1R01DK115217، DK034854 P30 هدك منحة، هارفارد طبية مدرسة ميلتون وجد ذلك أقدم الجوائز البحثية (412708)، إليانور والشاطئ كم “برنامج زمالة الذكرى” الخمسين، و (مؤسسة كاريبلو 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
