Här beskriver vi ett protokoll som tillåter histologiska och molekylär analys av huden prover efter Candida albicans intradermal injektion. Detta protokoll upprätthåller den strukturella integriteten av huden och möjliggör lokalisering av vävnad boförälder eller nyanställd immunceller som patogen distribution.
Huden är ett oerhört utökade organ i kroppen och på grund av denna stora yta, det utsätts kontinuerligt för mikroorganismer. Hudskador kan lätt leda till infektioner i dermis vilket i sin tur kan resultera i spridning av patogener i blodomloppet. Förstå hur immunförsvaret bekämpar infektioner i mycket tidigt skede och hur värden kan eliminera patogener är ett viktigt steg för att ange en bas för framtida terapeutiska interventioner. Här beskriver vi en modell av Candida albicans infektion som kan visualisera processer som inträffar tidigt under en infektion, inklusive när patogen har passerat den epiteliala barriären, liksom det immunsvar som framkallas av C. albicans invasionen. Vi använde denna infektion modell för att utföra histologiska analyser som visar de immunceller som infiltrerar huden samt närvaro och lokalisering av patogener. Prover som samlats in efter infektionen kan bearbetas för RNA-extraktion.
Den mänskliga kroppen är täckt med ett extremt högt antal mikroorganismer. Hudytan är en livsmiljö av nästan en miljon bakterier per kvadratcentimeter1. Detta nummer, dock återspeglar inte den full mängd mikroorganismer som colonizes huden. Förutom bakterier, är människokroppen koloniserade av många svamp arter, inklusive C. albicans, som är kompetent att överleva både i slemhinnor och hud nivå2.
Andelen personer som diagnostiserats med svampinfektioner ökat enormt under de senaste åren. Detta beror främst på det högre antalet immunsupprimerade personer, dvs., HIV-positiva patienter och patienter som har genomgått antingen kemoterapi eller Immunosuppressiva läkemedel efter transplantation3. I en övervakning studie utförd i USA, visade Wisplinghoff et al. att 9,5% av nosokomiala blodomloppet infektioner orsakas av Candida arter4. På grund av ökad förekomst av svampinfektioner, och särskilt på grund av förhöjda andelen Candida arter hittade under infektioner blodomloppet, är förstå hur denna patogen flyr kontroll av immunsystemet extremt viktigt.
C. albicans är en dimorfa svamp som växer i olika morfologiska former såsom jäst, blastospores, pseudohyphae och hyfer beroende på miljöförhållanden5. I sin hyphal form, C. albicans visar sin högsta invasivitet kapacitet och har förmågan att penetrera epitel6.
C. albicans infektioner har studerats med hjälp av flera experimentella metoder. Den vanligaste modellen av infektion är intravenös injektion av C. albicans jäst7. Men tar denna modell inte hänsyn till alla processer som hända innan svampen lyckas sprida sig in i blodomloppet. En annan modell tar fördel av C. albicans förmåga att invadera epitel. Denna metod, även känd som den sand papper modell8, utvecklades av Gaspari et al. 19989och består av att använda sand papper för att slipa huden, vilket eliminerar den hornlagret innan du applicerar C. albicans. Detta förfarande möjliggör svampen penetrera epitel, vilket möjliggör analys av denna patogen invasiv förmåga. Slutligen, andra modeller av infektioner för gastrointestinala10 och luftvägar11 har använts i olika studier.
Bildandet av ett sår (som sand pappersmodell) orsakar aktivering av flera vägar, inklusive immunceller rekrytering och aktivering, för att främja den läkande process12. Detta kan antingen ändra eller maskera immunsvar specifikt framkallade mot patogener, vilket leder till confounding resultat.
Här beskriver vi en metod för hudinfektion som undviker inledande såret bildandet och induktion av en basal inflammatoriska miljö. För att bibehålla intakt epitelial struktur, injicera vi direkt C. albicans i sin hyphal form i den djupa derma. Även om en enda injektion kan framkalla mild inflammation, mängden inflammation är begränsad och inskränkt jämfört med bildandet av ett öppet sår som sand pappersmodell. Den metod som vi beskriver här tillåter studier av immunsvaret mot svampinfektion och spridning samtidigt undvika överdriven och redan existerande inflammatoriska miljön som orsakas av mekaniska skador.
Här har vi beskrivit en metod av C. albicans infektion att studera den inflammatoriska processen som är initierade vid svamp ingången i den djupa derma.
Även om hud abscess formation är en relativt sällsynt händelse på C. albicans infektion15, tillåter injektion av svampen direkt i den djupa derma inte bara studier av svamp-driven abscess formation, men även analys av specifik immun celler som deltar innehåller svamp sprida. Med den metod so…
The authors have nothing to disclose.
FG stöds av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) och Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ stöds av NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton hittade, CCFA Senior forskning Awards (412708), den Eleanor och Miles Shore 50-årsjubileum Fellowship Program, och den Cariplo Foundation ( 2014-0859).
Reagents | |||
PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
Bacto Peptone | BD | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
Instrument | |||
Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
TissueLiser | QIAGEN | ||
Materials | |||
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
Surgical forceps | |||
Surgical scissors | |||
Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |