Dyp Dermal injeksjon som en modell av Candida albicans hudinfeksjon for histologiske analyser

Summary

Her beskriver vi en protokoll som tillater histologiske og molekylære analyse av hud prøver etter Candida albicans intradermal injeksjon. Denne protokollen opprettholder den strukturelle integriteten til huden og gir lokaliseringen av vev-bosatt eller nylig rekruttert immunceller samt patogen fordelingen.

Abstract

Huden er en ekstremt utvidet organ i kroppen, og på grunn av denne stor overflate, det utsettes kontinuerlig for mikroorganismer. Skade huden kan lett føre til infeksjoner i huden som kan i sin tur føre formidling av patogener i blodet. Forstå hvordan immunsystemet bekjemper infeksjoner på et veldig tidlig stadium og hvordan verten kan eliminere patogener er et viktig skritt å sette grunnlaget for fremtidige terapeutisk intervensjon. Her beskriver vi en modell av Candida albicans infeksjon som kan visualisere prosessene som oppstår tidlig under en infeksjon, inkludert patogen gått epithelial barrieren, samt immunrespons brakt frem av C. albicans invasjon. Vi brukte denne infeksjon modellen for å utføre histologiske analyser som viser immunceller som infiltrere huden samt tilstedeværelse og lokalisering av patogen. Prøver samlet etter infeksjon kan behandles for RNA utvinning.

Introduction

Kroppen er dekket med et ekstremt høyt antall mikroorganismer. Hudoverflaten er tilholdssted for nesten en million bakterier per kvadratcentimeter¹. Dette nummeret, men reflekterer ikke full rekke mikroorganismer som colonizes huden. I tillegg til bakterier, er menneskekroppen kolonisert av mange fungal arter, inkludert C. albicans, som er i stand til å overleve både på slimhinnene og huden nivå².

I de senere årene har økt andelen av mennesker diagnostisert med soppinfeksjoner enormt. Dette er hovedsakelig på grunn av høyere antall immunsupprimerte personer, dvs, HIV-positive pasienter og pasienter som har gått gjennom kjemoterapi eller suppressive medikamenter etter transplantasjon³. I en overvåking studie utført i USA, viste Wisplinghoff et al. at 9.5% av nosokomiale blodbanen infeksjoner ble forårsaket av Candida arter⁴. På grunn av økte forekomsten fungal infeksjoner, og spesielt på grunn av opphøyet prosentandelen av Candida arter finnes i blodbanen infeksjoner, er forstå hvordan denne patogen unnslipper kontroll av immunsystemet ekstremt viktig.

C. albicans er en dekket av hvit sopp som vokser i morfologiske former som gjær, blastospores, pseudohyphae og hyfer avhengig av miljøforhold⁵. I sin hyphal form, C. albicans viser høyeste invasiveness kapasiteten og evnen til å trenge epitel⁶.

C. albicans infeksjoner har studert ved bruk av flere eksperimentelle tilnærminger. Den vanligste av infeksjon er intravenøs injeksjon av C. albicans gjær⁷. Men tar denne modellen ikke hensyn alle prosesser som skjer før soppen klarer å spre inn i blodbanen. En annen modell utnytter muligheten for C. albicans å invadere epitel. Denne metoden, også kjent som sand papir modell⁸, ble utviklet av Gaspari et al. i 1998⁹, og består av å bruke sand papir for å Rue huden, dermed eliminere i stratum corneum før C. albicans. Denne prosedyren kan soppen å trenge epitel, dermed muliggjør analyse av invasiv evnene til denne patogen. Til slutt, andre modeller av infeksjoner for gastrointestinal¹⁰ og luftveier¹¹ har vært brukt i forskjellige studier.

Dannelsen av en såret (som sand papir modell) forårsaker aktivering av flere veier, inkludert immun celle rekruttering og aktivisering, for å fremme den helbredende prosess¹². Dette kan endre eller maske immunrespons spesielt skapte mot patogen, dermed fører til confounding resultater.

Her beskriver vi en metode for hudinfeksjon som unngår første såret dannelse og induksjon av en basal inflammatorisk miljø. For å opprettholde intakte epithelial strukturen, injisere vi direkte C. albicans i sin hyphal form i de dype derma. Selv om en enkelt injeksjon kan framprovosere mild betennelse, beløpet av inflammation er begrenset og begrenset sammenlignet med dannelsen av et åpent sår i sand papir modellen. Tilnærmingen som vi beskriver her kan studiet av immunforsvaret til soppinfeksjon og spredning og unngå overdreven og eksisterende inflammatorisk miljøendringer forårsaket av mekanisk skade.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent under institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og drives under oppsyn av Institutt for dyr ressurser på barn ‘s Hospital (ARCH) ved Boston Children’s Hospital eller ble godkjent av italienske Helsedepartementet og utført under institusjonelle dyr omsorg komiteen på Universitetet i Milano-Bicocca. 1. C. albicans forberedelse Kultur C. albicans, belastning CAF3-113, i rør som inneholder rik medium (…

Representative Results

Igjennom innsprøytingen av patogen direkte i den dype derma forblir strukturelle morfologi av vev intakt (figur 1A). Vedlikehold av huden konstruksjonssikkerhet tillater påvisning av immunceller og deres lokalisering på stedet av infeksjonen. Høyere forstørrelsen vist i figur 1B avslører at byllen består hovedsakelig av polymorfonukleære leukocytter (PMCs) som i…

Discussion

Her beskrev vi en metoden for C. albicans infeksjon å studere den inflammatoriske prosessen som startes ved fungal inngangen i den dype derma.

Selv om huden abscess dannelse er en relativt sjelden hendelse på C. albicans infeksjon¹⁵, tillater injeksjon av sopp direkte i den dype derma ikke bare studiet av sopp-drevet abscess dannelse, men også analyse av spesifikk immun celler som inneholder fungal spredt. Med metoden beskrevet her, er det mulig å …

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998