A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjelp av Dot Blotting analyse

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å forberede Aβ oligomers fra en syntetisk peptid i vitro og å vurdere relativ mengder Aβ oligomer ved en prikk blotting analyse.

Abstract

Β-amyloid (Aβ) er en hydrofobe peptid med en iboende tendens til å selv sette sammen til aggregatene. Blant ulike aggregatene, Aβ oligomer er allment akseptert som den ledende neurotoxin i utviklingen av Alzheimers sykdom (AD) og anses å være den avgjørende hendelsen i patogenesen av Annonsen. Derfor Aβ oligomer hemmere kan forhindre neurodegeneration og har potensial til å bli utviklet som sykdomsmodifiserende behandling av Annonsen. Imidlertid kan forskjellige formasjon protokoller av Aβ oligomer føre til oligomers med ulike egenskaper. Videre er det ikke mange metoder for å effektivt skjermen Aβ_1-42 oligomer hemmere. Et A11 antistoff kan reagere med et delsett av giftige Aβ_1-42 oligomer med anti-parallell β arks strukturer. I denne protokollen beskriver vi hvordan å forberede et A11-positive Aβ_1-42 oligomer-rike utvalg av en syntetisk Aβ_1-42 peptid i vitro og evaluere relativ mengder A11-positive Aβ_1-42 oligomer i prøver av en prikk blotting analyse bruker A11 og Aβ_1-42-spesifikke 6E10 antistoffer. Bruker denne protokollen, kan hemmere av A11-positive Aβ_1-42 oligomer også bli vist fra semi kvantitative eksperimentelle resultater.

Introduction

Alzheimers sykdom (AD) er en av de viktigste nevrodegenerative sykdommene som påvirker eldre mennesker over hele verden¹. Det er allment akseptert at unormal aggregering av β-amyloid (Aβ) kan være den ledende patologiske faktoren av Annonsen. Aβ aggregater er hovedkomponentene i senil plaketter, en av de biologiske markørene i hjernen til AD pasienter. Videre produsere Aβ aggregat, inkludert oligomers spesielt potente nevrotoksisitet, som kan være årsaken til nevronale død som AD pågår. Derfor hemming av Aβ oligomer formasjon kan hindre neurodegeneration og Aβ oligomer hemmere kunne utvikles som sykdom-modifisere behandlinger av Annonsen. Mange studier har brukt et syntetisk Aβ peptid å danne oligomers i vitro, utforske morphologies og strukturer i kunstig Aβ oligomers og undersøke hemmere av Aβ oligomer bruker i vitro modeller^{2,3 , 4}. imidlertid forskjellige i vitro formasjon protokoller av Aβ oligomer kan føre til oligomer med forskjellige morfologiske kjennetegn, som kan føre til de uforlignelige resultatene blant forskjellige forskningsgrupper. Derfor, en standard formasjon protokoll for Aβ oligomer er haster.

Inntil nå har ikke mange metoder blitt rapportert å oppdage direkte Aβ oligomers. Overføring elektronisk mikroskopi (TEM), ikke-denaturing gel geleelektroforese, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) og dot blotting analyse kan brukes til å undersøke beløp og/eller morfologi av Aβ oligomer i vitro^{5, 6}. For eksempel morfologi og strukturen i Aβ oligomer kan observeres i TEM. De relative mengdene og molekylær størrelse av Aβ samlinger kan måles ved ikke-denaturing gel geleelektroforese. ELISA kan brukes til å fastslå Aβ oligomer i serum, plasma og utdrag fra hjernevev. Til slutt, dot blotting analyse, en teknikk som brukes for å oppdage, analysere og identifisere proteiner, kan brukes til å evaluere den relative konsentrasjonen av Aβ oligomer i forskjellige prøver med hjelp av oligomer-spesifikk og Aβ-spesifikke antistoffer. Videre gir en prikk blotting analysen vesentlige tidsbesparelser, gel gelelektroforese og gels blotting prosedyrer ikke er nødvendig. Derfor denne analysen er vanligvis brukt til skjermen potensielle Aβ oligomer hemmere. Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive en relativt enkel, pålitelig og reproduserbar metode for å forberede en Aβ_1-42 oligomer-rik prøve, å analysere mengder Aβ_1-42 oligomer av dot blotting analyse og skjermen Aβ oligomer hemmere bruker semi kvantitative eksperimentelle resultater.

Protocol

1. løsning forberedelse Merk: Se Tabell for materiale for reagens kilder. Forbered en 5% bovin serum albumin (BSA) løsning ved å legge til 5 g av BSA 100 mL dobbel-destillert vann. Bland dem helt av vortexing dem. Lagre løsningen på 4 ° C i opptil 1 måned. Forberede en anti-oligomer antistoff A11 løsning (1:1, 000) ved å legge 10 µL av antistoff lagerløsning 10 mL av 5% BSA løsningen. Bland dem helt av vortexing dem. Lagre løsningen på 4 ° C …

Representative Results

For å undersøke om en Aβ1-42 monomer kan danne en Aβ1-42 oligomer etter forberedelse, ble TEM analyse brukt. Ingen synlige oppsamlinger ble observert i HFIP-oppløst Aβ1-42 monomer utvalget (figur 1A). Videre hovedsakelig globular aggregater med en diameter på rundt 10-80 nm ble observert i Aβ1-42 utvalget etter 48 timer med risting, antyder at Aβ1-42 danner oligomers etter forber…

Discussion

I denne protokollen, har vi rapportert en metode å forberede prøver som inneholder Aβ_1-42 oligomer og analysere mengder A11-positive Aβ_1-42 oligomer ved en prikk blotting analyse. Selv om våre metoder for utarbeidelsen av Aβ_1-42 oligomer-rik prøver er ganske enkel, pålitelig og reproduserbare, er det fortsatt noen poeng legges merke til. For det første HFIP til å oppløse den syntetiske Aβ_1-42 peptid. En oppsamlet Aβ_1-42 peptid kan Demonter til monomer i …

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi