여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.
포유류 생식 생물학의 분야에 있는 연구는 종종 난소와 고환의 전반적인 건강을 평가 포함 됩니다. 특히, 여성, 난소 피트 니스는 시각화 및 낭과 oocytes를 측정 하 여 평가 자주. 난소는 불투명 한 3 차원 조직 이기 때문에 전통적인 접근 힘들게 부 러 뜨 리는 조직의 수많은 직렬 섹션으로 전체 기관에 걸쳐 세포를 시각화 하기 위해 필요 합니다. 또한,이 방법으로 정량화는 일반적으로 점수는 oocyte의 대략적인 직경에 의해 구분 된 섹션의 하위 집합만 수반, 때문에 그것은 부정확 하 경향이 있다. 여기, 프로토콜 대신 전체 장기 조직 개간 및 면역 형광 마우스 난소 낭과 oocytes 시각화의 얼룩을 활용 하 여 설명 합니다. 전통적인 방법에 비해,이 프로토콜은 수많은 이유로 난소 내 세포를 시각화에 대 한 유리: 1) 난소 보존할 샘플 준비와 처리; 섹션에 어렵다, 2) 작은 난소; 쉽게 시험 될 수 있다 3) 세포질 부 량은 더 쉽게 그리고 정확 하 게 달성; 그리고 4) 몇 군데 전체 기관.
세포질 구성 및 포유류 난소의 형태학 상 특징을 공부 하기 위하여 과학자 들은 종종 vivo에서 실험 뒤에 immunohistological 포함 된 파라핀 난소의 얼룩에 의존 합니다. 최근에 그러나, 전체 난소 기관 문화 기술은 더 나은 시각화와 결합 될 수 있다 때문에 난소 기능1,2,,34 를 공부 하는 효과적인 대안이 될 수 입증 하고있다 더 많은 고 정량화 도구입니다. 전통적으로, 난소 형태학의 분석 3 차원 재구성 난소 아키텍처 파라핀 임베디드 직렬 섹션에서 하지만 되기 힘들고 시간이 걸리고, 순차적으로 포함 된 파라핀 조직 단면에 따라 달라 집니다. 기관의 적절 한 개조를 보장 하지 않으며 섹션 자주 분실 또는 잘못 주문 과정에서.
직렬 구분과 관련 된 기술 과제, 이외에 정기적으로 여 포 난소5,6당 숫자를 계량 하는 데 사용 하는 방법에 변화가 있습니다. 현재 사용 하는 방법론 변화 연구5,7에 걸쳐 난소의 메타 분석을 손상 한다. 예를 들어 다른 연구 기사에서 여 포 숫자 특정 스트레인6내에서 유사한 발달 세 사이 이상의 사진에 의해 달라질 수 있습니다. 보고 뿌리 부 량에 큰 차이이 혼란으로 이어질 수 있습니다 고 간 연구 비교를 방해. 실험적으로, 직렬 섹션에서 뿌리 정량화 하는 기존의 방법과 섹션의 미리 정의 된 수의 모 낭을 계산 하 여 수행 됩니다 (예를 들어, 모든 다섯 번째, 10 번째, 또는 다른 섹션). 이 방법을 사용 하 여 포 수 있는 가변성 섹션 두께, 경험과 기술 직렬 섹션5,6생성에 섹션 계산에 주기에서 뿐만 아니라 변화에서 발생 합니다. 그것의 다양성 뿐만 아니라 다른 전통적인 조직 단면 단점은 젊은 동물에서 작은 난소의 단면화는 특히 도전적이 고 매우 조직 방향8에 의존.
프로토콜 아래 일상적으로 사용 된 난소 문화 기술1 설명 하지만 전통적인 뿌리 정량화 조직 삭제와 실제 단면 및 광학 단면 confocal 현미경8 사용 하 여 대체 하 여 크게 향상 시켰습니다. ,9. 에 요소 및 솔 비 톨-기반 조직 집중 (하지 않아도 transcranial 관류 또는 전기 이동 법)을 사용 하 여 삭제 솔루션 (예를 들어, ScaleS(0)10)는 immunostaining와 호환 되 고 입증의 감소에 대 한 허용 화상의 깊이 손상 없이 개간 시간. 다른 보고 된 방법 (예, ScaleA28,10, SeeDB11,12, ClearT 및 ClearT212) 하나 더 많은 시간을 소비 또는 샘플의 깊이 있는 광학 해상도 허용 하지 않습니다. 광 단면 적은 노동 집약 이며 오르간의 3 차원 건축7,8을 유지 하기 때문에 유리 하다. 이 방법의 또 다른 이점은 샘플의 준비 조직을 값비싼 시 약을 필요로 하지 않습니다 및 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다.
특히, 설명 하는 프로토콜은 출생 후 하루 5 교양된 마우스 난소에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 출생 후 일 0-10에서에서 배열 하는 난소에 실시 되었습니다. 메서드는 자연스럽 게 조직에 그것은 경작, 기관 처리 및 조작을 용이 하 게 하는 막에 부착 하는 난소 문화 시스템을 사용. 설명 하는 문화 시스템 최대 10 일 동안을 어떻게 다른 실험 조건 평가 explanted 난소 oocyte 생존13방해할 수 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 설명 정량화 절차 처리 패키지 피지 ImageJ14 비 상업적 이미지를 사용 하 여 수행 하 고 대부분 개인용 컴퓨터에서 수행할 수 있습니다. 또한, 정량화에 대 한 사용 되는 이미지 만들 수 있습니다 광범위 하 게 사용할 수 있는 미래의 메타 분석에 대 한 되므로, 사회 과학에 대 한.
포유류 복제의 연구를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양에 의무가 있지 않은 특수 셀을 측정 해야 합니다. 그러나, 문화 시스템 비보 전 난소 및 여 포 생존1,15유지에 효과적입니다. 난소 문화 중 조직 확산을 통해 영양분의 교환에 대 한 더 큰 표면 영역을 필요합니다. 따라서, 5 일 오래 된 마우스 난소 크기에 이상적입니다 및 장기 문화에 대 한 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리 유용한 제안 및 기술 지원에 대 한 레 베 카 윌리엄스와 코넬 BRC 이미징에서 요한 나 델라 크루스와 앤드류 Recknagel 감사합니다. 이 작품 건강 그랜트의 국가 학회에 지원 되었다 S10-OD018516 (코넬의 이미징 시설)에, J.C.B.에 T32HD057854와 J.C.S. R01-GM45415
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
10mL Syringes | BD | 309695 | |
Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |