Hier presenteren we een protocol om te kwantificeren follikels in gekweekte eierstokken van jonge Muizen zonder seriële segmenteren. Met behulp van hele orgel immunofluorescentie en weefsel wissen, is fysieke segmenteren vervangen door optische segmenteren. Deze methode voor de bereiding van de monsters en visualisatie handhaaft integriteit van orgel en vergemakkelijkt geautomatiseerde kwantificering van specifieke cellen.
Onderzoek op het gebied van zoogdieren reproductieve biologie brengt vaak evaluatie van de algehele gezondheid van eierstokken en teelballen. Met name bij vrouwtjes, wordt ovariële fitness vaak beoordeeld door visualiseren en kwantificeren van de follikels en eicellen. Omdat het vruchtbeginsel een ondoorzichtige drie-dimensionale weefsel is, vereisen traditionele benaderingen moeizaam het weefsel in talrijke seriële secties opsplitsen om te visualiseren van cellen in het gehele orgaan. Bovendien, omdat kwantificering door deze methode houdt meestal slechts een subset van de secties gescheiden door de geschatte diameter van een oöcyt scoren is het vatbaar voor onjuistheden. Hier, wordt een protocol beschreven dat in plaats daarvan maakt gebruik van hele orgel weefsel clearing en immunofluorescentie kleuring van muis eierstokken te visualiseren follikels en eicellen. Vergeleken met meer traditionele benaderingen, dit protocol is gunstig voor het visualiseren van de cellen binnen het ovarium voor tal van redenen: 1) het vruchtbeginsel blijft intact gedurende de bereiding van de monsters en verwerking; 2) kleine eierstokken, die moeilijk te sectie, kunnen worden onderzocht met gemak; 3) cellulaire kwantificering meer gemakkelijk en nauwkeurig gebeurt; en 4) het hele orgel beeld.
Om het onderzoek naar de cellulaire samenstelling en morfologische kenmerken van zoogdieren eierstokken, afhankelijk wetenschappers vaak van in vivo experimenten gevolgd door immunohistological kleuring van paraffine ingesloten eierstokken. Meer recent echter hele eierstok orgel cultuur heeft bewezen een effectief alternatief voor het bestuderen van ovariële functie1,,2,,3,4 , omdat de techniek kan gepaard gaan met betere visualisatie en kwantificering tools. Traditioneel, analyse van ovariële morfologie is afhankelijk van reconstructie driedimensionale ovariële het platform van paraffine ingesloten seriële secties, maar naast het feit dat moeizaam en tijdrovend, serieel afdelen paraffine ingesloten weefsel garantie niet juiste reconstructie van het orgel en secties zijn vaak verloren of verkeerd besteld in het proces.
Naast de technische uitdagingen in verband met seriële afdelen, zijn er ook variaties in de gehanteerde routinematig kwantificeren follikel nummers per eierstok5,6. De methodologische variabiliteit momenteel gebruikt schaadt meta-analyse van ovariële reserve over studies5,7. Follikel nummers uit verschillende onderzoeksartikelen kan bijvoorbeeld variëren door 10-fold of meer tussen soortgelijke developmental leeftijden binnen een specifieke stam6. Deze grote verschillen in de gerapporteerde follikel kwantificering kunnen leiden tot verwarring en cross-studie vergelijkingen hebben gestaan. Experimenteel, traditionele benaderingen follikel kwantificering van seriële secties worden uitgevoerd door het tellen van de follikels van een vooraf gedefinieerde aantal secties (b.v., elke vijfde, tiende, of een andere sectie). Variabiliteit in de follikel graven met behulp van deze aanpak ontstaat niet alleen uit de periodiciteit in welke secties worden geteld maar ook uit de variaties in de dikte van de sectie, en technische ervaring bij het genereren van seriële secties5,6. Naast haar variabiliteit is een ander nadeel van traditionele weefsel segmenteren dat het segmenteren van kleine eierstokken van jonge dieren vooral een uitdaging en sterk afhankelijk is van een weefsel geaardheid8 is.
Het onderstaande protocol beschrijft een routinematig gebruikte eierstok cultuur techniek1 maar sterk verbetert bij traditionele follikel kwantificering te vervangen door fysieke segmenteren met weefsel clearing en optische afdelen met behulp van de confocal microscopie8 ,9. Wissen met behulp van weefsel onderdompeling (zonder de noodzaak voor transcraniale perfusie of voor elektroforese) in een ureum en sorbitol-gebaseerde oplossing (b.v., ScaleS(0)10) bewezen compatibel met de immunokleuring en toegestaan voor de vermindering van clearing tijd zonder diepte voor imaging. Andere gemelde methoden (b.v., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, en ClearT212) bevinden zich meer tijd consumeren of niet toestaan grondig optische resolutie van het monster. Optische segmenteren is voordelig, omdat het is minder arbeidsintensief en het orgel van driedimensionale het platform7,8 onderhoudt. Een ander voordeel van deze aanpak is dat de voorbereiding van de monsters geen dure reagentia vereist te wissen van het weefsel en kan worden uitgevoerd met relatief gemak.
Met name het protocol beschreven is geoptimaliseerd voor gekweekte muis eierstokken op postnatale dag vijf maar werd uitgevoerd op de eierstokken variërend van postnatale dag 0 – 10. De methode maakt gebruik van een eierstok cultuur systeem waarin het weefsel natuurlijk aan het membraan waarop het is gekweekt hecht, orgel behandeling en manipulatie te vergemakkelijken. Het systeem van de cultuur zoals beschreven kan worden gebruikt om transplanteren eierstokken voor maximaal 10 dagen en te beoordelen hoe verschillende experimentele omstandigheden kunnen interfereren met de oöcyt overleving13. De kwantificering beschreven procedure wordt uitgevoerd met behulp van de niet-commerciële pakket FIJI-ImageJ14 voor beeldverwerking en kan worden uitgevoerd op de meeste personal computers. Bovendien kunnen beelden gebruikt voor kwantificering wijd-beschikbaar gemaakt te worden voor de wetenschappelijke gemeenschap, waardoor voor toekomstige meta-analyse.
De studie van zoogdieren reproductie vereist gebruiken en kwantificeren van gespecialiseerde cellen die niet routinematig vatbaar voor celkweek. Ex vivo cultuur systemen zijn echter effectief bij het handhaven van de eierstok en follikel levensvatbaarheid1,15. Tijdens de eierstok cultuur vereist het weefsel een groter oppervlak voor uitwisseling van voedingsstoffen via diffusie. Daarom 5 – dagen oude muis eierstokken zijn ideaal in grootte en vorm voor o…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Rebecca Williams en Johanna Dela Cruz van de Cornell BRC Imaging en Andrew Recknagel voor nuttige suggesties en technische bijstand. Dit werk werd gesteund aan de nationale instituten van gezondheid subsidie S10-OD018516 (naar Cornell’s Imaging Facility), T32HD057854 tot J.C.B. en R01-GM45415 naar J.C.S.
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
10mL Syringes | BD | 309695 | |
Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |