Hela berget immunofluorescens och follikeln kvantifiering av odlade mus äggstockarna
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera folliklar i odlade äggstockarna av unga möss utan seriell sektionering. Använda hela orgel immunofluorescens och vävnad clearing, ersätts fysiska snittning med optisk snittning. Denna metod för provberedning och visualisering underhåller orgel integritet och underlättar automatiserade kvantifiering av specifika celler.
Abstract
Forskning inom området för däggdjur reproduktionsbiologi innebär ofta utvärdera övergripande hälsa för äggstockar och testiklar. Specifikt, i kvinnor bedöms cystor fitness ofta av visualisera och kvantifiera folliklar och oocyter. Eftersom äggstockarna är en ogenomskinlig tredimensionella vävnad, kräver traditionella metoder mödosamt skivning vävnaden i många seriella sektioner för att visualisera cellerna i hela hela orgeln. Dessutom eftersom kvantifiering av denna metod innebär vanligtvis scoring endast en delmängd av avsnitten åtskilda av ungefärlig diameter en äggcell, är det benägna att felaktighet. Här beskrivs ett protokoll som istället utnyttjar hela orgel vävnad clearing och immunofluorescens färgning av mus äggstockarna att visualisera folliklar och oocyter. Jämfört med mer traditionella metoder, detta protokoll är fördelaktigt för att visualisera celler i äggstocken för många skäl: 1) äggstocken förblir intakt under hela provberedning och bearbetning. (2) små äggstockar, som är svåra att avsnitt, kan undersökas med lätthet; (3) cellulär kvantifiering uppnås lättare och korrekt; och 4) hela orgeln avbildas.
Introduction
För att studera cellulära sammansättningen och morfologiska egenskaper av däggdjur äggstockar, forskare förlitar sig ofta på i vivo experiment följt av immunohistological färgning av paraffin inbäddade äggstockarna. Mer nyligen dock hela äggstocken orgelkultur har visat sig vara ett effektivt alternativ till studien äggstockarnas funktion1,2,3,4 eftersom tekniken kan kopplas till bättre visualisering och verktyg för kvantifiering. Traditionellt, analys av äggstockscancer morfologi är beroende av rekonstruktionen tredimensionella cystor arkitekturen från paraffin inbäddade seriell avsnitt, men, förutom att vara mödosam och tidskrävande, seriellt snittning paraffin inbäddade vävnad gör inte garanti ordentlig ombyggnad av orgeln, och sektioner ofta förloras eller mis beställde i processen.
Förutom de tekniska utmaningar i samband med seriell sektionering, finns det också variationer i de metoder som rutinmässigt används för att kvantifiera follikeln nummer per äggstock5,6. Det metodologiska variabilitet som för närvarande används försämrar meta-analys av äggreserven över studier5,7. Till exempel varierar follikeln nummer från olika forskningsartiklar 10-faldig eller mer mellan liknande utvecklingsmässiga åldrar inom en viss stam6. Dessa stora skillnader i rapporterade follikeln kvantifiering kan leda till förvirring och har hindrat cross-studien jämförelser. Experimentellt, traditionella metoder för follikeln kvantifiering från seriell avsnitt utförs genom att räkna folliklar av ett fördefinierat antal sektioner (t.ex. var femte, tionde, eller andra avsnitt). Variabilitet i follikeln räknar med detta synsätt uppstår inte bara från periodiciteten i vilka delar räknas men även från variationer i snittjocklek och teknisk erfarenhet inom generera serial avsnitten5,6. Förutom dess variationer är en annan nackdel med traditionell vävnad snittning att snittning av små äggstockar från unga djur är särskilt utmanande och starkt beroende av vävnad orientering8.
Protokollet nedan beskriver en rutinmässigt används äggstock kultur teknik1 men förbättrar kraftigt traditionella follikeln kvantifiering genom att ersätta fysiska snittning med vävnad clearing och optisk snittning med konfokalmikroskopi8 ,9. Rensa med vävnad nedsänkning (utan behovet av transkraniell perfusion eller elektrofores) i en urea – och sorbitol-baserade lösning (t.ex. ScaleS(0)10) visat sig vara kompatibla med immunfärgning och tillåtet för minskning av avfärgningstiden utan att kompromissa med djup Imaging. Andra rapporterade metoder (t.ex., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12och ClearT212) är antingen mer tidsödande eller Tillåt inte djupgående optisk upplösning av provet. Optisk snittning är fördelaktigt eftersom det är mindre arbetsintensivt och upprätthåller de en orgel tredimensionella arkitektur7,8. En annan fördel med denna metod är att beredningen av proverna inte kräver kostsamma reagenser att rensa vävnaden och kan utföras med relativ lätthet.
Specifikt, det protokoll som beskrivs har optimerats för odlade mus äggstockarna på postnatal dag fem men har utförts på äggstockarna alltifrån postnatal dag 0 – 10. Metoden använder sig av en äggstock kultur system där vävnaden naturligt tillmäter membranet som är det odlade, underlätta orgel hantering och manipulation. Kultur systemet beskrivs kan användas för att upprätthålla explanterad äggstockarna för upp till 10 dagar och att bedöma hur olika experimentella förhållanden kan störa äggcellen överlevnad13. Rapporteringsgräns förfarandet utförs med icke-kommersiella bildbehandling paketet FIJI-ImageJ14 och kan utföras på de flesta persondatorer. Bilder som används för kvantifiering kan dessutom göras allmänt tillgängliga för forskarsamhället, vilket möjliggör framtida metaanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien av däggdjur reproduktion kräver hjälp och kvantifiera specialiserade celler som inte rutinmässigt mottagliga för cellodling. Men är ex vivo kultur system effektiva på att upprätthålla äggstock och follikeln livskraft1,15. Under äggstock kultur kräver vävnaden en större yta för utbyte av näringsämnen genom diffusion. Därför 5 – dag-gammal mus äggstockarna är perfekta i storlek och form för orgelkultur. Detta protokoll var opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Rebecca Williams och Johanna Dela Cruz från den Cornell BRC Imaging och Andrew Recknagel för användbara förslag och tekniskt bistånd. Detta arbete fick stöd till National Institutes of Health grant S10-OD018516 (till Cornells Imaging anläggning), T32HD057854 till J.C.B. och R01-GM45415 till J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts – not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, (2017).
