Vi præsenterer her, en protokol for at kvantificere follikler i kulturperler æggestokkene af unge mus uden seriel skæring. Brug hele orgel immunofluorescens og væv clearing, er fysiske skæring erstattet med optisk skæring. Denne metode til forberedelse af prøver og visualisering fastholder orgel integritet og letter automatiserede kvantificering af specifikke celler.
Forskning inden for pattedyr reproduktiv biologi indebærer ofte, vurdere den generelle sundhed i æggestokke og testikler. Specifikt, i kvinder vurderes æggestokkene fitness ofte ved visualisering og kvantificere follikler og oocyter. Fordi æggestokken er en uigennemsigtig tredimensionale væv, kræver traditionelle metoder møjsommeligt udskæring af væv i talrige seriel sektioner for at visualisere celler i hele hele orglet. Desuden, fordi kvantificering af denne metode indebærer typisk, scorede kun et undersæt af de dele, adskilt af en oocyt omtrentlige diameter, det er udsat for unøjagtighed. Her, er en protokol, der beskrevet som i stedet udnytter hele organ væv clearing og immunfluorescens farvning af musen æggestokkene til at visualisere follikler og oocyter. I forhold til mere traditionelle tilgange, denne protokol er en fordel for visualisere celler i æggestokkene af mange årsager: 1) æggestokken forbliver intakt hele prøveforberedelse og behandling; 2) små æggestokke, som er vanskelige at sektion, kan undersøges med lethed; 3) cellulære kvantificering er mere let og præcist opnåede; og 4) hele orglet afbildet.
For at studere cellulær sammensætning og morfologiske funktioner af pattedyr æggestokke, afhængige forskere ofte i vivo eksperimenter efterfulgt af immunohistological farvning af paraffin indlejret æggestokke. Mere for nylig om hele æggestokken orgel kultur har vist sig for at være et effektivt alternativ til at studere ovarie funktion1,2,3,4 , fordi teknikken kan være kombineret med bedre visualisering og kvantificering værktøjer. Traditionelt, afhænger analyse af æggestokkene morfologi voldsomme tredimensionale æggestokkene arkitektur fra indlejret serie paraffinsnit, men ud over at være besværlige og tidskrævende, seriefremstillede skæring paraffin indlejret væv ikke garanti for korrekt rekonstruktion af orglet, og sektionerne er ofte tabt eller mis bestilt i processen.
Ud over de tekniske udfordringer forbundet med seriel skæring, er der også forskelle i de metoder, der rutinemæssigt anvendes til at kvantificere follikel numre pr. æggestokken5,6. Den metodologiske variabilitet i øjeblikket anvendes forringer meta-analyse af ovariereserven på tværs af undersøgelser5,7. For eksempel, kan follikel tal fra forskellige forskningsartikler variere ved 10-fold eller mere mellem lignende udviklingsmæssige aldre inden for en bestemt stamme6. Disse store forskelle i rapporterede follikel kvantificering kan føre til forvirring og har hindret cross-undersøgelse sammenligninger. Eksperimentelt, traditionelle tilgange til hårsækken kvantificering fra seriel sektioner er udført ved at tælle follikler af et foruddefineret antal sektioner (fx hver femte, tiende, eller andre afsnit). Variation i hårsækken tæller ved hjælp af denne fremgangsmåde opstår ikke kun fra hyppighed i hvilke afsnit tælles, men også fra variationer i snittykkelse og teknisk erfaring til at generere serielle afsnit5,6. Ud over sin variation er en anden ulempe ved traditionelt væv skæring, skæring af små æggestokke fra unge dyr er især udfordrende og meget afhængige af væv orientering8.
Protokollen nedenfor beskriver et rutinemæssigt anvendes æggestokken kultur teknik1 men i høj grad forbedrer efter traditionelle follikel kvantificering ved at erstatte fysisk skæring med væv clearing og optisk kontinuerlig skæring ved hjælp af Konfokal mikroskopi8 ,9. Clearing ved hjælp af væv nedsænkning (uden brug af transkranial perfusion eller elektroforese) i en urea – og sorbitol-baseret løsning (f.eks. ScaleS(0)10) viste sig at være forenelig med immunfarvning og tilladt til reduktion af clearing tid uden at kompromittere dybde af billedbehandling. Andre rapporterede metoder (fx, ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, og ClearT212) er enten mere tid forbruge eller Tillad ikke dybdegående optisk opløsning af prøven. Optisk skæring er fordelagtig, fordi det er mindre arbejdsintensive og vedligeholder orglet tredimensionale arkitektur7,8. En anden fordel ved denne tilgang er, at forberedelsen af prøverne ikke kræver dyre reagenser til at klare væv og kan udføres med relativ lethed.
Specifikt, protokollen beskrevet er blevet optimeret til kulturperler mus æggestokkene på postnatal dag fem men er blevet gennemført på æggestokkene spænder fra postnatal dag 0 – 10. Metoden gør brug af en æggestok kultur system som vævet naturligvis tillægger membranen som, det er kulturperler, lette orgel håndtering og manipulation. Kultur-systemet beskrevet kan bruges til at opretholde eksplanterede æggestokkene i op til 10 dage og at vurdere, hvordan forskellige eksperimentelle betingelser kan forstyrre oocyt overlevelse13. Kvantificering proceduren udføres ved hjælp af den ikke-kommercielle billedbehandling pakke FIJI-ImageJ14 og kan udføres på de fleste pc’er. Desuden kan billeder, der bruges til kvantificering gøres alment tilgængelig for det videnskabelige samfund, således at fremtidige meta-analyse.
Studiet af pattedyr reproduktion kræver hjælp og kvantificere specialiserede celler, der ikke er rutinemæssigt indstillet til cellekultur. Men ex vivo kultur systemer er effektive på at opretholde en æggestok og follikel levedygtighed1,15. Under æggestokken kultur kræver vævet et større areal til udveksling af næringsstoffer gennem diffusion. Derfor, 5 – dages gammel mus æggestokkene er ideelle i størrelse og form for orgel kultur. Denne prot…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Rebecca Williams og Johanna Dela Cruz fra Cornell BRC Imaging og Andrew Recknagel for nyttige forslag og teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet til nationale kontorer i sundhed grant S10-OD018516 (til Cornell’s Imaging facilitet), T32HD057854 til J.C.B. og R01-GM45415 til J.C.S.
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
10mL Syringes | BD | 309695 | |
Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |