Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at generere insulin udtrykker 3D murine pancreatoids fra frit svævende e10.5 adskilles i bugspytkirtlen ophav og den tilknyttede udkom.
Abstract
Bugspytkirtlen er et komplekst organ sammensat af mange forskellige celletyper, der arbejder sammen om at regulere blod glukose homøostase og fordøjelse. Disse celletyper omfatter enzym-secernerende acinar celler, et arborized duktalt system ansvarlig for transport af enzymer til de gut, og hormon-producerende endokrine celler.
Endokrine beta-celler er den eneste celle i kroppen, som producerer insulin til at sænke blodsukkerniveauet. Diabetes, en sygdom karakteriseret ved tab eller dysfunktion af beta-celler, er ved at nå epidemiske højder. Det er således afgørende for at fastlægge protokoller for at undersøge beta-celle udvikling, der kan bruges til screening for at udlede narkotika- og cellebaseret terapi. Mens den eksperimentelle undersøgelse af mus udvikling er væsentlige, er i vivo undersøgelser besværlig og tidskrævende. Dyrkede celler giver et mere praktisk platform for screening; men de er ude af stand til at opretholde den cellulære mangfoldighed, arkitektoniske organisation og cellulære vekselvirkninger fundet in vivo. Det er således vigtigt at udvikle nye værktøjer til at undersøge i bugspytkirtlen organogenesis og fysiologi.
Pancreas epitelceller udvikle i nære forhold til udkom fra starten af organogenesis som celler organisere og differentiere sig til den komplekse, fysiologisk kompetente voksne orgel. Pancreas udkom giver vigtige signaler for endokrine udvikling, hvoraf mange ikke er vel forstået endnu, således vanskeligt at sammenfatte under in vitro- kultur. Her, beskriver vi en protokol til kultur tre-dimensionelle cellulære komplekse mus organoids, der bevarer udkom, betegnes pancreatoids. E10.5 murine pancreas bud er dissekeret, adskilles og kulturperler i et stillads-frit miljø. Disse flydende cellerne samle selv med udkom omsluttende den udvikle pancreatoid og en robust antal endokrine beta-celler udvikle sammen med de acinar og kanalen celler. Dette system kan bruges til at studere de celle skæbne beslutsomhed, strukturelle organisation og morfogenese, celle-celle interaktioner under organogenesis, eller for narkotika, lille molekyle eller genetisk screening.
Introduction
Afgrænse mekanismerne i den normale udvikling og fysiologi er afgørende at forstå sygdom ætiologi og i sidste ende dyrke behandlingsmetoder. Samtidig dyrkning og differentiering stamceller giver hurtig og høj overførselshastighed analyse af udvikling, det er begrænset af det eksisterende organ viden med hensyn til mekanismer, der regulerer celle skæbne og kunstigt sammenfatter udviklingen i en relativt homogen, to-dimensionelle tilstand1,2. Ikke kun i vivo udvikling påvirket af ydre påvirkninger, med forskellige celletyper i niche og milieu leverer paracrine signaler og organisatorisk støtte til at guide organogenesis, men funktionen af disse celler også bygger på deres omgivelser for vejledning3,4,5. Betragtning af betydningen af disse eksterne stikord, begrænsninger af differentiering protokoller og den møjsommelige karakter af i vivo musemodeller, nye systemer er nødvendige for at eksperimentelt undersøge basale udviklingsprocesser og fysiologi.
Fremkomsten af protokoller til at generere tredimensionelle, komplekse organoids giver en bekvem og sammenfaldende system for at studere organogenesis, fysiologi, medicin effektivitet og endda patogenese. Oprettelse af murine organoids for forskellige systemer såsom mave6 og tarmen7 har udvidet vores forståelse af organogenesis, der giver et værktøj til at studere udviklingsmæssige kompleksiteter med færre begrænsninger end in vivo og in vitro- modeller. På grund af disse fremskridt i den murine organoid dannelse og fremkomsten af humane pluripotente stamceller celler, humane intestinal8, retinal9, renal10,11, og cerebral12 organoids er blevet produceret, og dette Repertoiret er kun begrænset af den eksisterende viden om mekanismerne for udvikling.
Af særlig interesse er generation af pancreas organoids, som et utal af sygdomme plager forskellige pancreas celletyper, herunder acinar celler og kanalerne i eksokrine pancreas insufficiens13, acinar celler i pancreatitis14, og beta celler i diabetes15. At få viden om udviklingen af disse forskellige celletyper kunne støtte i at forstå deres patologi og kan også fungere som en platform for personlig stof screening eller transplantation. Tidligere var udviklet Greggio et al. en metode til at oprette murine pancreas organoids, at sammenfatte i vivo morfogenese og udvikle organiseret, tre-dimensionelle, komplekse strukturer sammensat af alle større pancreas epitelcelle typer16,17. Dette er et stort skridt fremad i feltet i bugspytkirtlen, især som gør celler i vitro kan aktivere biologisk undersøgelse af beta-celle udvikling. Men en mangel på endokrine celler dannet i denne protokol medmindre organoids blev transplanteret ind i vævet, hvor niche kunne interagere og leverer instruktions stikord17. Udkom udgør den største del af niche, stærkt omsluttende udvikle epitel fra tidlige stadier af organogenesis til senere faser herunder endokrine delaminering og differentiering3,4, 18. Samspillet mellem udkom og udviklende bugspytkirtlen er endnu et eksempel af extrinsic signalering og betydningen af at opretholde i vivo cellulære kompleksitet at studere organogenesis.
Her, beskriver vi, hvordan du generere tredimensionelle pancreas organoids, betegnes pancreatoids, fra dissocierede e10.5 murine pancreas stamfaderen. Disse pancreatoids bevarer oprindelig udkom, selv samle i frit svævende betingelser og generere alle vigtig pancreas celletyper, herunder en robust antal endokrine betaceller19. Denne fremgangsmåde er bedst egnet til analyse af endokrine udvikling, da tidligere protokoller mangler robust endokrine differentiering. Men ved hjælp af protokollen for pancreas organoids som beskrevet af Greggio et al. er bedre egnet til analyse af pancreas epitelial forgrening og morfogenese, som forgrener sig er mere begrænset i pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
Progression af celle kultur modeller er afgørende for korrekt modeludvikling, producere klinisk relevante celletyper, test narkotika effektivitet eller endda transplantation til patienter. Dog kunstigt recapitulating udviklingen i en parabol udfordrende, som vi er stadig langt fra at forstå mekanismerne organogenesis og fysiologi in vivo. In vitro- celler er således ineffektivt genereret, ikke fuldt funktionelle, kan ikke opretholdes i længere tid, eller havnen andre afvigelser fra sammenlignelige c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jolanta Chmielowiec for nyttige diskussionen om protokollen og manuskriptet. Vi takker også Benjamin Arenkiel for adgang til Konfokal mikroskop. Dette arbejde blev støttet af NIH (P30-DK079638 til M.B.) og T32HL092332-13 M.A.S. og M.B., McNair medicinsk Foundation (til M.B.) og konfokal kernen på BCM intellektuelle og udviklingsforstyrrelser Research Center (NIH U54 HD083092 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute for børns sundhed og menneskelige udvikling).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
