الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي
Summary
تحديد المتغيرات الجينية المساهمة في الأمراض البشرية المعقدة يسمح لنا بتحديد آليات جديدة. وهنا، علينا أن نظهر نهجاً متعدد الوراثي للجينات المرشحة أو تحليل مسار الجين الذي يزيد من تغطية تكلفة منخفضة وهي قابلة للدراسات الفوجية.
Abstract
وكثيراً ما تستند الأمراض المعقدة متعددة المتغيرات الجينية المشتركة التي تسهم في قابلية المرض. هنا، يمكننا وصف نهج تعدد الأشكال (SNP) النوكليوتيدات واحدة علامة فعالة من حيث التكلفة باستخدام فحص الوراثي متعدد مع الكتلي، للتحقيق في الجينات الطريق رابطات في الأفواج السريرية. نحن التحقيق موضع المرشح الحساسية الغذائية Interleukin13 (IL13) على سبيل مثال. هذا الأسلوب كفاءة تكبير التغطية بالاستفادة من اختلال الصلة المشتركة (LD) داخل منطقة. المحدد LD بطانات ثم صممت في تحليل متعدد، تمكين بطانات مختلفة تصل إلى 40 يتم تحليلها في الوقت نفسه، تعزيز الفعالية من حيث التكلفة. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تستخدم لتضخيم المكاني هدفا، يليه النوكليوتيدات واحدة، وتقاس في أمبليكونس ثم استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-الوقت من flight(MALDI-TOF) الكتلي. ويتم تحليل الناتج الخام مع النمط الوراثي تطلق على البرمجيات، واستخدام تعريفات مراقبة الجودة الصارمة وانقطاع، وتحدد الأنماط الجينية الاحتمالية العالية والإخراج لتحليل البيانات.
Introduction
في الأمراض البشرية المعقدة، المتغيرات الجينية تساهم قابلية المرض والتحديد الكمي لهذه المتغيرات قد تكون مفيدة لفهم الآلية المرضية، تحديد مجموعات المرضى عالية المخاطر، ومعاملة المستجيبين. في الواقع، الوعد بدقة الطب تعتمد على الاستفادة من المعلومات الجينية لتحديد مجموعات فرعية المريض1. ولسوء الحظ، داخل الفضاء بيولوجيا الأمراض المعقدة، حيث تعمل المرض هي مدعومة بالتغاير الوراثي الكبير، بينيترانسي منخفضة، والتعبيرية متغير، الفوج حجم الاحتياجات للنهج الشاملة للجينوم التعرف على الرواية المرشحين غالباً ما تكون باهظة كبيرة2. بدلاً من ذلك، يبدأ نهج جينات مستهدفة مرشح بداهة فرضية حول الجينات/مسارات محددة في مسببات المرض3. أدوات تحليل المسار تستخدم عادة للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية المكاني الهدف المحدد، توليد عدة مسارات المرشح استكشاف. علينا أن نظهر هنا نهجاً متعدد التنميط يسمح لتحقيق عشرات ومئات بطانات بمقايسة واحدة، مناسبة ل الدراسات الفوجية البشرية4. وهذا النهج مرتفع نسبيا من خلال، ضع، السماح لمئات آلاف عينات الحمض النووي لتكون جينوتيبيد لدراسات اكتشاف الرواية والتحقيق في مسارات محددة. الأساليب المذكورة هنا مفيدة لتحديد المخاطر الآليلات وروابطها مع السمات السريرية بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا. وكان هذا المنهاج مفيد جداً للفحص والتشخيص أغراض5،6، وأكثر في الآونة الأخيرة، للعدوى الميكروبية7 و8من فيروس الورم الحليمي البشري.
ويبدأ هذا البروتوكول مع اختيار مجموعة من الجينات للتحقيق، أي.، المناطق المستهدفة، عادة ما تحدد من خلال البحث في الأدب، أو فرضيات مسبقاً للمشاركة في عملية المرض؛ أو ربما المحدد للنسخ المتماثل كالرابطات الرائدة لدراسة الجينوم على نطاق الرابطة (GWA) اكتشاف. من مجموعة الجينات، وسوف حدد الباحث قائمة العلامة بطانات المكرر. هو اختلال الربط (دينار)، أو العلاقة بين المتغيرات في المنطقة يستخدم لتحديد ممثل ‘الوسم SNP’ لمجموعة من بطانات في LD عالية، المعروف باسم هابلوتيبي. LD عالية في المنطقة يعني أن بطانات غالباً موروثة معا من التنميط SNP واحدة غير كافية لتمثل الاختلاف في بطانات جميع في هابلوتيبي أن. بدلاً من ذلك، إذا كانت متابعة قائمة نهائية من بطانات من العديد من المناطق، على سبيل المثال-، النسخ المتماثل لدراسة GWA، قد تكون هذه العملية غير ضرورية. للتنميط متعدد، ثم ينبغي تصميم مقايسة حول هذه الأهداف الإشعال التضخيم من اختلاف الجماعية لتلك كبسولة تفجير ملحق والمنتجات لإنتاج التفسير الشامل الأطياف. وتنفذ هذه المعلمات بسهولة بتصميم أداة فحص الوراثي متعدد. سيتم استخدام الإشعال إلى الأمام وعكس من هذا التصميم لاستهداف علامات الاهتمام وتضخيم تسلسل يحتوي على الحزب الوطني اﻻسكتلندي. كبسولة تفجير ملحق إرفاق الدانية مباشرة إلى بطانات وإضافة قاعدة واحدة، وكتلة معدلة، ‘المدمر’ مكملة للحزب الوطني اﻻسكتلندي. كذلك يمنع قاعدة المنهي التمديد للحمض النووي. الكتلة–تعديل القاعدة تمكن أجزاء مختلفة من قاعدة واحدة الكشف عنها بواسطة الطيف الكتلي. ثم يتم تطبيق لوحة تحتوي على مادة الكيمياء الوراثي لشريحة للقياس على منصة الكتلي. بعد تطبيق ضوابط الجودة المناسبة لدعوات التنميط الخام الكشف عنها بواسطة النظام، يمكن تصدير البيانات ويستخدم للتحليل الإحصائي لاختبار الارتباط مع المرض تعمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، علينا أن نظهر أسلوب التنميط متعدد باستخدام الطيف الكتلي. نتائج تمثيلية تم إنشاؤها باستخدام PCR يقترن استخدام-TOF الكتلي4 مع الكيمياء الإنزيم المدرجة في الجدول للمواد13. مع هذا النظام الأساسي، ونحن إنشاء مجموعة من الأنماط الجينية 11,295 على الأفراد 1,255 لبط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين قد لا شكر وتقدير.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
