Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie
Summary
Identifizierung von Genvarianten, die einen Beitrag zur komplexen menschlichen Krankheit ermöglicht neuartige Mechanismen zu identifizieren. Hier zeigen wir einen Multiplex-Genotypisierung Ansatz Kandidatengene oder Weg Genanalyse, die maximiert die Reichweite bei niedrigen Kosten und Kohorte-Studien zugänglich ist.
Abstract
Komplexe Krankheiten werden oft durch mehrere gemeinsame genetische Varianten untermauert, die Krankheitsanfälligkeit beitragen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Tag Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Ansatz mit einem gemultiplexten Genotypisierung Assay mit Massenspektrometrie, gen Weg Verbände in klinischer Kohorten zu untersuchen. Wir untersuchen Lebensmittel Allergie Kandidat Locus Interleukin13 (IL13) als Beispiel. Diese Methode maximiert effizient die Berichterstattung unter Ausnutzung der gemeinsamen Gestänge Ungleichgewicht (LD) innerhalb einer Region. Ausgewählten LD SNPs sind dann in einen Multiplex-Assay konzipiert ermöglichen bis zu 40 verschiedene SNPs gleichzeitig analysiert werden, Steigerung der Wirtschaftlichkeit. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um den Ziel-Loci, gefolgt von Einzel-Nukleotid-Erweiterung zu verstärken und die Amplifikate sind dann mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit der flight(MALDI-TOF) Massenspektrometrie gemessen. Die raw-Ausgabe wird mit dem Genotyp ruft Software, mit strengen Qualitätskontrolle Definitionen und Cut-Offs, analysiert und mit hoher Wahrscheinlichkeit Genotypen sind bestimmt und Ausgang für die Datenanalyse.
Introduction
In komplexen Krankheiten genetische Varianten tragen zur Krankheitsanfälligkeit und Quantifizierung dieser Varianten kann nützlich sein für Verständnis Pathogenese, hohes Risiko Patientengruppen und Behandlung Responder zu identifizieren. In der Tat ist das Versprechen der präzisionsmedizin Nutzung genomischer Informationen zur Identifizierung von Patientengruppen1abhängig. Leider innerhalb der komplexen Krankheit Biologie Raum, wo Krankheit Phänotypen durch erhebliche genetische Heterogenität, geringe Penetranz und variabler Expressivität untermauert werden, Kohorte Größe Anforderungen für genomweite Ansätze zu identifizieren, Roman Kandidaten sind oft übermäßig groß2. Alternativ beginnt ein gezielte Kandidat gen Ansatz mit einer a priori Hypothese über bestimmte Gene/Wege in Krankheit Ätiologie3. Pfad-Analyse-Tools werden häufig verwendet, um die Pathophysiologie der eine identifizierte Ziel Loci, erzeugen zahlreiche Kandidaten Wege erforscht werden zu untersuchen. Wir zeigen hier einen gemultiplexten Genotypisierung Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Dutzende bis Hunderte von SNPs mit einem Assay, geeignet für menschlichen Kohorten Studien4. Dieser Ansatz ist relativ hohen Durchsatz, Hunderte bis Tausende von DNA-Proben für neuartige Entdeckung Studien genotypisiert sein und Untersuchung der spezifischen Bahnen erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden eignen sich für identifizierende Risiko-Allele und ihre Verbände mit klinischen Merkmale auf eine relativ schnelle und kostengünstige Weise. Diese Plattform ist sehr vorteilhaft für Screening und diagnostische Zwecke5,6, und seit kurzem auch für mikrobielle Infektion7 und humanes Papillomavirus8gewesen.
Dieses Protokoll beginnt mit der Auswahl aus einer Reihe von Genen für Untersuchung, d. h.., den Zielregionen, in der Regel bestimmt durch Literatur suchen oder a priori Hypothesen für die Beteiligung an den Krankheitsprozess; oder vielleicht für die Replikation als den führenden Vereinigungen einer Entdeckung genomweite (GWA) Studie ausgewählt. Aus dem Gen-Set wird der Forscher des Tags SNPs einen raffinierten auswählen. Das heißt, ist die Verknüpfung Ungleichgewicht (LD) oder die Korrelation unter den Varianten in der Region zum Vertreter ‘Tag SNP’ für eine Gruppe von SNPs in hohen LD, bekannt als ein Haplotyp identifizieren. Die hohen LD der Region bedeutet, dass die SNPs oft zusammen vererbt werden, so dass Genotypisierung ein SNP ausreichen, um die Variation an allen SNPs in den Haplotyp vertreten ist. Alternativ, wenn auf eine endgültige Liste der SNPs aus vielen Regionen, z.B.Follow-up., Replikation für eine GWA-Studie, dieser Prozess möglicherweise unnötig. Für Multiplex Genotypisierung ist ein Test dann um diese Ziele auszulegen, so, dass die Verstärkung Zündkapseln sind unterschiedlicher Masse derjenigen die Verlängerung Zündkapseln und Produkte herstellen interpretierbaren Spektren Masse. Diese Parameter werden leicht durch ein Multiplex Genotypisierung-Assay-Design-Tool implementiert. Die Forward- und reverse Primer von diesem Design werden verwendet werden, Zielen auf die Markierungen des Interesses und verstärken die Sequenz, die SNP enthält. Die Erweiterung Primer Anhängen direkt proximal zu den SNPs und eine einzelne, Masse verändert, ‘Terminator’-Basis, die komplementär zu der SNP ist hinzugefügt. Die Terminator Basis verhindert eine weitere Verlängerung der DNA. Die Masse-Modifikation des Sockels kann Fragmente abweichend von einer einzelnen Base von Massenspektrometrie detektiert werden. Die Platte enthält die Genotypisierung Chemie wird dann auf einen Chip für die Messung auf einer Plattform Massenspektrometrie angewendet. Nach der Anwendung entsprechende Qualitätskontrollen, die rohen Genotypisierung Anrufe vom System erkannt, können die Daten exportiert und verwendet zur statistischen Auswertung, um Verbindung mit Krankheit Phänotypen zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Methode der gemultiplexten Genotypisierung mittels Massenspektrometrie. Die repräsentativen Ergebnisse wurden mittels PCR gepaart mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie4 mit Assay Chemie entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien13generiert. Mit dieser Plattform haben wir insgesamt 11.295 Genotypen auf 1.255 Einzelpersonen für 9 SNPs innerhalb von 40 Stunden im Labor erzeugt.
Wir verdeutlichen den Nutzen der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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