Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.
Abstract
במשך כמעט 40 שנה, הזרקת הדנ א pronuclear מייצג את השיטה הרגילה כדי להפיק העכברים הטרנסגניים עם שילוב אקראי של transgenes. בדיקה שגרתית הוא מנוצל באופן נרחב ברחבי העולם ומתגורר הגבלה העיקריים שלה היעילות העניים של אינטגרציה transgene, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה של מייסד חיות. רק אחוזים בודדים של בעלי חיים שנולד אחרי ההשתלה של oocytes מופרית מוזרק שילבו את transgene. לעומת זאת, וקטורים lentiviral הם כלים רבי-עוצמה עבור העברה גנטית אינטגרטיבית, השימוש שלהם כדי מגלי oocytes מופרית מאפשר הפקה יעילה במיוחד של מייסד העכברים הטרנסגניים עם תשואה ממוצעת מעל 70%. יתר על כן, כל זן העכבר יכול לשמש כדי לייצר חיים מהונדס, והוא penetrance הביטוי transgene גבוהה מאוד, מעל 80% עם lentiviral transgenesis בתיווך בהשוואה ל- DNA microinjection. גודל המקטע דנ א זה יכול להיות מטען על ידי וקטור lentiviral מוגבל ל 10 kb ומייצג המגבלה העיקרית של שיטה זו. שימוש פשוטה וקלה לביצוע הליך הזרקת מתחת zona pellucida של oocytes מופרית, יותר מ 50 מייסד בעלי חיים יכול להיות מיוצר בחצר מושב בודד של microinjection. השיטה היא מאוד מותאם לביצוע, ישירות במייסד חיות, רווח מהיר, אובדן של תפקוד לימודי או לאזורים דנ א גנומי מסך, ביכולתם לשלוט ולווסת ג’ין ביטוי ויוו.
Introduction
עבודתה החלוצית של גורדון. et al. 1980 הראה כי לאחר ההשתלה בעכברים pseudopregnant, דנ א פלסמיד הזרקה לתוך זכר pronuclei של oocytes מופרית ניתן תשואות ייצור הטרנסגניים חיות משולב פלסמיד DNA1. ההפגנה יונקים הטרנסגניים יכול להיווצר הייתה השפעה עצומה על מדעי החיים הכללית, פתיחת הדרך לשדות הרומן של המחקר הן עבור מדעי ביו translational מדעים בסיסיים. ארבע העשורים האחרונים, הפך ה-DNA microinjection אימון שגרתי. למרות מספר עצום של העכברים הטרנסגניים הופקו, השיטה הרגילה אינה שמישים לחלוטין עבור כל עכבר זנים ודורשת זמן רב בנשימה ובריכוז2,3. היישום שלה למינים אחרים נותר מאתגר4 , התשואה הכוללת של אינטגרציה transgene מוגבלת כמה אחוז בעלי חיים נולד ב5. בנוסף, היעילות של אינטגרציה transgene מייצג את הגורם המגביל המסביר את התשואה הכוללת המסכן של הזרקת הדנ א pronuclear. במובן זה, וקטורים ויראלי אינטגרטיבית הם הכלים היעילה ביותר כדי מטען לשלב את transgenes ואת ובכך יכול לספק אמצעי חדש להגביר משמעותית את התשואה אינטגרציה, המגבלה היחידה כל כך גודל transgene לא עולה על 10 kb6 .
מדומים מוקלד עם החלבון envelop וירוס Vesicular Stomatitis (VSV) lentiviral וקטורים הם כלי העברת הגנים pantropic ו אינטגרטיבית מאוד והוא יכול לשמש כדי מגלי מופרית oocytes7. Zona pellucida המקיפים את oocytes היא מכשול טבעי וירוס וצריך לעבור כדי לאפשר התמרה חושית עם הווקטורים lentiviral. חיות הטרנסגניים נוצרו על-ידי transducing oocytes מופרית לאחר קידוח מיקרו או הסרה של8, zona pellucida9. עם זאת, הזרקה מתחת zona pellucida בחלל perivitelline נראה כי השיטה הפשוטה ביותר כדי מגלי הביצים כפי שמתואר בתחילה על ידי לואיס ועמיתיו7.
הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral מאפשרת תפוקה גבוהה ייצור הטרנסגניים חיות מעל 70% של בעלי חיים נולד. תשואה כזו היא מעל 10-fold גבוה יותר מאשר התשואה הטובה ביותר זה יכולה להיות מושגת באמצעות תקן pronuclei DNA הזרקת7,10,11. בהקשר זה, מושב בודד של זריקות יפיק לפחות 50 הטרנסגניים המייסדים (F0). המספר הגדול של מייסדי הוא, לכן, תואם עם phenotyping של האפקט transgene מתבצע ישירות על עכברים F0 ללא צורך ליצור קווים העכבר מהונדס. יתרון זה מאפשר להקרנה מהירה של האפקט transgene, מותאם במיוחד לביצוע ויוו להפסד ורווח של מחקרים פונקציה בתוך שבועות. בנוסף, רכיבי ה-DNA תקינה יכולים גם להיות במהירות מוקרן למפות משפרי ומוטיבים DNA מחויב על ידי שעתוק גורמים11,12. עם זריקות pronuclear, transgenes בדרך כלל לשלב עותקים מרובים כמו ב לוקוס ייחודי. עם וקטורים lentiviral, אינטגרציה מתרחשת לוקוסים מרובים כעותק יחיד לכל לוקוס10,13. לכן, הריבוי של לוקוסים משולב הוא ככל הנראה קשור penetrance ביטוי גבוהה מאוד שנצפתה הטרנסגניים המייסדים, מה שהופך את המודל החדש שנוצר עמידים יותר.
חשוב, כאשר באמצעות הזרקת pronuclear של ה-DNA, ויזואליזציה של pronuclei במהלך ההליך הוא בהחלט נדרש. מגבלה טכנית זו מונעת את השימוש oocytes מופרית שמקורם במגוון גדול של זנים העכבר. לכן, הפקה של מודל הטרנסגניים מסוימים מסננים עבור אילו pronuclei הן בלתי נראות דורש את הייצור של בעלי חיים בגן זן מתירניות ואחריו בנשימה ובריכוז רצופים לפחות 10 כדי להעביר את transgene העכבר הרצוי זן. עם הזריקות וקטור lentiviral, שטח perivitelline גלוי תמיד ואת הזריקה אינה דורשת מיומנויות ספציפיות מאוד. לדוגמה, העכברים הטרנסגניים הנד/SCID אינן מתאימות pronuclei הזרקת הושגו עם זריקות וקטור ויראלי14.
. הנה, פרוטוקול מקיף מוצג כדי לאפשר ייצור פשוטה של העכברים הטרנסגניים באמצעות זריקות lentiviral וקטור במרחב perivitelline של העובר בשלב תא אחד. הביטוי Transgene נשלט עם כל אחד בכל מקום או תאים ספציפיים היזמים מתואר בפירוט.
PTrip ΔU3 עמוד השדרה lentiviral היה בשימוש במחקר זה15. וקטור זה מאפשר הפקת שכפול וקטורים lentiviral הפגום שבו הרצף U3 חלקית נמחק כדי להסיר U3 יזם פעילות ולהפיק וקטור (חטא) עצמית inactivating16. וקטור lentiviral מניות יוצרו על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK-293T עם p8.91 כימוס פלסמיד (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, קידוד ה גליקופרוטאין-G וירוס (VSV) vesicular stomatitis17, ו ΔU3 pTRIP את pHCMV-G וקטור recombinant. הנוהל מפורט ייצור מסופק שיטות משלימות.
הפקה של כייל נוגדנים גבוה וקטור lentiviral מניות מבוצעת בתנאים אבטחה ברמה II (BSL-2). זה נכון לגבי רוב transgenes חוץ oncogenes חייב להיות מיוצר BSL-3. לכן, ייצור בתנאים BSL-2 ברוב המקרים מספיקה. בנוסף, השימוש ואת הייצור מנותקים בדרך כלל עבור סוכנויות רגולציה הלאומית ביותר העוסקים אורגניזמים מהונדס גנטית (GMO). כמות מוגבלת של שכפול לא מוכשר חטא lentiviral וקטורים (מתחת µg 2 של חלבון p24 capsid) יכול לשמש בתנאים BSL-1 כפי שתואר על ידי הסוכנות הצרפתית GMO מסכים עם המלצות האיחוד האירופי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרקה perivitelline של וקטורים lentiviral ב oocytes מופרית המתוארים כאן הביא ייצור הטרנסגניים עוברי הניב יותר מ 70% של העוברים הטרנסגניים ביחס המספר הכולל של עוברי שנאספו. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים, מדגימה יחודיות של הליך2,7,10,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Magali דומונט, מלוני רולנדו על קריאה ביקורתית של כתב היד ואת iVector Phenoparc ICM ליבות לקבלת סיוע טכני בארצות וקטור lentiviral הייצור של בעלי חיים דיור בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי דה Translationnelles אינסטיטוט Hospitalo-Universitaire דה מדעי המח בפריז, IHU-A-ICM, Investissements d’Avenir ANR-10-IAIHU-06. יחסי ציבור קיבל מימון עבור פרנסז Langue de האגודה למזוג l’Etude du Diabète et des מחלות Métaboliques (ALFEDIAM), של האגודה לסוכרת נעורים משותפת / INSERM הענק.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
