आंतों बाधा उल्लंघन के बाद माइक्रोबियल व्युत्पंन उत्पादों के प्रवेश द्वार नकल करने के लिए चूहों में Lipopolysaccharide के इंजेक्शन
Summary
यहां एक प्रोटोकॉल आंतों बाधा उल्लंघन के बाद बैक्टीरियल व्युत्पंन यौगिकों के प्रवेश की नकल करने के लिए प्रस्तुत किया है । lipopolysaccharide के एक कम घातक खुराक चूहों में प्रणालीबद्ध इंजेक्ट किया गया था, जो 24 एच के बाद इंजेक्शन के लिए निगरानी की गई. समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की अभिव्यक्ति तिल्ली, जिगर, और बृहदांत्र में कई समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था ।
Abstract
आंत्र उपकला बाधा microbiota कि आम तौर पर सहन या नजरअंदाज कर दिया है से मेजबान अलग । इस बाधा का उल्लंघन बैक्टीरिया या बैक्टीरिया के प्रवेश में परिणाम-व्युत्पंन उत्पादों की मेजबानी में, मेजबान परिसंचरण और भीतरी अनियंत्रित सूजन के लिए अग्रणी अंगों तक पहुंचने के रूप में भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) के साथ रोगियों में मनाया, कि एक वृद्धि हुई आंत्र उपकला पारगम्यता की विशेषता है.
मेजबान में जीवाणु-व्युत्पन्न यौगिकों के प्रवेश की नकल करने के लिए, एक endotoxemia मॉडल अपनाया गया है जिसमें lipopolysaccharide (एलपीएस), ग्राम के बाहरी कोशिका दीवार के एक घटक नकारात्मक बैक्टीरिया, चूहों में इंजेक्ट किया गया. इस अध्ययन में, एलपीएस की एक घातक खुराक intraperitoneally इंजेक्शन था और चूहों के बाद 8 एक रोग स्कोर का उपयोग कर एच के लिए निगरानी की गई. इसके अलावा, भड़काऊ साइटोकिंस की अभिव्यक्ति का स्तर Il6, Il1b, और Tnfa तिल्ली, जिगर और बृहदांत्र में qPCR द्वारा अलग समय अंक पोस्ट एलपीएस इंजेक्शन में विश्लेषण किया गया । यह मॉडल सूक्ष्मजीवों या जीवाणु-व्युत्पंन शरीर की एक बाधा उल्लंघन की वजह से उत्पादों के आक्रमण के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच को शामिल अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है सतहों ।
Introduction
मानव आंत सूक्ष्मजीवों कि microbiota, जो विकास के दौरान मेजबान के साथ एक पारस्परिक रूप से लाभप्रद संबंध विकसित किया है रूपों के एक बड़े संघ के साथ बृहदांत्र है । इस रिश्ते में, मेजबान microbiota के लिए एक सुरक्षित जगह प्रदान करता है, जबकि microbiota विटामिन, पोषक तत्व पाचन और मेजबान है, जहां microbiota1रहता है रोगजनकों से सुरक्षा प्रदान करता है । जब मेजबान और microbiota के बीच यह लाभकारी संबंध अशांत होता है, तो रोग विकसित हो सकते हैं, जैसे भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) । आईबीडी दो प्रमुख रूपों, Crohn की बीमारी (सीडी) और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) में होते हैं कि आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की वजह से आंत की एक multifactorial पुरानी भड़काऊ बीमारी है । दो आईबीडी रूपों के बीच समानता के बावजूद, वे स्थान और भड़काऊ संशोधनों की प्रकृति में कुछ मतभेदों की विशेषता है । सीडी एक retransmural भड़काऊ विकार है कि संभवतः जठरांत्र संबंधी मार्ग के किसी भी हिस्से को विस्तार कर सकते है, जबकि यूसी गैर transmural है और बृहदांत्र के लिए प्रतिबंधित है । इसके अलावा, न्यूक्लियोटाइड में उत्परिवर्तनों oligomerization डोमेन-प्रोटीन युक्त 2 (NOD2), एक पैटर्न मांयता रिसेप्टर (पीआरआर) है कि muramyl dipeptide (एचडीपी), सबसे ग्राम के सेल दीवार के एक घटक को पहचानता है-सकारात्मक और नकारात्मक बैक्टीरिया, CD2के साथ संबद्ध है । इसके अलावा, ई कोलाई (ई. कोलाई), लिस्टिरिया और स्ट्रेप्टोकोक्की और उनके उत्पादों सब सीडी रोगियों कि एक बाधा उल्लंघन के बाद मेजबान में प्रवेश किया है में मैक्रोफेज के भीतर पाया गया3। जब बैक्टीरिया या उनके उत्पादों की सीडी के विकास के दौरान मेजबान में प्रवेश, प्रतिरक्षा प्रणाली एक प्रतिक्रिया विरोधी घूम के उत्पादन के लिए अग्रणी बैक्टीरियल एंटीबॉडी4विकसित करता है । हो सकता है, आईबीडी के रोगजनन में microbiota की भूमिका के लिए सबसे कायल सबूत माउस मॉडल से उपजा है । जब जानवरों एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं, या जब चूहों रोगाणु मुक्त (gf) स्थितियों में रखा जाता है, रोग की गंभीरता सबसे कोलाइटिस मॉडल में कम है, जैसे IL-10-/चूहों में कोलाइटिस का विकास नहीं करते हैं gf सुविधाओं में5,6. इसके अलावा, कोलाइटिस भी microbiota की संरचना है, जो एक असंतुलित संरचना और कम dysbiosis7बुलाया समृद्धि की विशेषता है परेशान करता है । आईबीडी का परिणाम एक वृद्धि हुई आंत्र पारगम्यता कि रोगाणुओं और माइक्रोबियल-व्युत्पंन उत्पादों की मेजबानी में प्रवेश करने के लिए नेतृत्व कर सकते हो सकता है ।
पशुओं में, Dextran सोडियम सल्फेट के आवेदन (DSS) एक आंत्र उपकला उल्लंघन उपकला बाधा8की वृद्धि हुई पारगम्यता के लिए अग्रणी लाती है. पोर्टल एलपीएस सांद्रता DSS कोलाइटिस के साथ जानवरों में ऊंचा कर रहे हैं9. दिलचस्प है, जानवरों सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर विशिष्ट intracellular आसंजन अणु की कमी-3 हथियाने nonintegrin homolog-संबंधित 1 (साइन-R1) DSS कोलाइटिस और एलपीएस-प्रेरित endotoxemia से संरक्षित कर रहे हैं10. आगे की मेजबानी में प्रसार करने के लिए, बैक्टीरिया या बैक्टीरिया व्युत्पंन उत्पादों संवहनी बाधा11, पेरिटोनियल गुहा, जिसमें छोटी और बड़ी आंत स्थित है पास है, mesenteric लिम्फ नोड्स और/या जिगर12। इस प्रणाली की जटिलता को कम करने के लिए, एक परिभाषित जीवाणु-व्युत्पंन यौगिक का इस्तेमाल किया गया था । एलपीएस, जो intraperitoneal के बाद endotoxemia का कारण बनता है (आईएफसआई) या नसों में (i.v.) इंजेक्शन13 चूहों में इंजेक्ट किया गया था, interleukins के जवाब में Il6 और आईएलबीएस और cytokine Tnfa की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए.
एलपीएस एक रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) ग्राम के एक सेल दीवार घटक के रूप में व्यक्त नकारात्मक बैक्टीरिया, कि लिपिड एक (एलपीएस की संरचना में मुख्य PAMP) के होते हैं, एक कोर oligosaccharide और एक ओ साइड चेन14. टोल रिसेप्टर की तरह 4 (TLR4) वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त की, और उपकला कोशिकाओं एलपीएस15पहचानता है, कि उचित बाध्यकारी के लिए सह रिसेप्टर्स की आवश्यकता है. तीव्र चरण प्रोटीन एलपीएस-बाध्यकारी प्रोटीन (LBP) बांध एलपीएस एक जटिल है कि अंतर के क्लस्टर के लिए एलपीएस स्थानांतरण 14 (CD14), एक glycosylphosphatidylinositoled झिल्ली प्रोटीन लंगर । CD14 आगे शटल एलपीएस लिम्फोसाइट प्रतिजन ९६ करने के लिए या भी एमडी-2, जो TLR4 के extracellular डोमेन के साथ जुड़ा हुआ है के रूप में जाना जाता है । एमडी-2 के लिए एलपीएस के बंधन TLR4/एमडी-2 के dimerization की सुविधा के लिए intracellular एडेप्टर अणुओं की भर्ती करने के लिए अनुप्रवाह संकेतन मार्ग14है, जो माइलॉयड विभेद प्राथमिक शामिल है सक्रिय करने के लिए गठन के परिवर्तन प्रेरित प्रतिक्रिया जीन ८८ (MyD88)-निर्भर मार्ग और तिर डोमेन-युक्त एडेप्टर-उत्प्रेरण इंटरफेरॉन-β (TRIF)-निर्भर मार्ग16. TLR4 द्वारा एलपीएस की मान्यता तब NF-κB मार्ग को सक्रिय करता है और TNFα, il-6, और il-1β के रूप में भड़काऊ साइटोकिंस, की अभिव्यक्ति लाती है17.
विशेष रूप से, जब एलपीएस पशुओं में इंजेक्शन है, पशुओं को दी एलपीएस की एकाग्रता, पशु की आनुवंशिक पृष्ठभूमि और आहार पर विचार किया जाना है । एलपीएस के उच्च सांद्रता एक सेप्टिक सदमे की ओर जाता है, हाइपरटेंशन और कई अंग विफलताओं की विशेषता है, और अंत में18मौत के लिए । चूहों एलपीएस के लिए कम संवेदनशील है मनुष्यों की तुलना में, जहां एलपीएस सांद्रता के बीच 2-4 एनजी/किलो शरीर के वजन (BW) के लिए एक cytokine तूफान19प्रेरित कर रहे हैं । चूहों के लिए, घातक खुराक (LD50), जो चूहों के आधे में मौत लाती है 10-25 मिलीग्राम/kg BW20 से माउस के आधार पर इस्तेमाल किया तनाव । के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया माउस उपभेदों, C57Bl/6 और बालब/सी, घातक खुराक ५०% (LD50) है 10 मिलीग्राम/BW । इसके विपरीत, उपभेदों C3H/HeJ और C57BL/10ScCr एलपीएस प्रेरित endotoxemia है, जो Tlr421में उत्परिवर्तनों के कारण है से संरक्षित हैं । नतीजतन, Tlr4 की कमी चूहों को एलपीएस के साथ इंजेक्शन के लिए hyporesponsive हैं22. अंय आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों, जैसे PARP1-/चूहों को एलपीएस-प्रेरित विषाक्त सदमे के लिए प्रतिरोधी रहे हैं ।
माउस मॉडल यहां वर्णित एलपीएस प्रशासित प्रणालीबद्ध के एक घातक खुराक शरीर की सतहों के उल्लंघन के बाद एक बाधा एलपीएस प्रसार के परिणामों की नकल का उपयोग करता है । चुना एलपीएस एकाग्रता (2 mg/BW) C56Bl/6 चूहों में मृत्यु दर प्रेरित नहीं किया, लेकिन समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के प्रेरित रिलीज.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं है कि माइक्रोबियल व्युत्पंन उत्पादों द्वारा आक्रमण के बाद हो नकल करता है । प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम माउस लाइन का चयन कर रहे हैं, चूहों की स्वच्छता की स्थि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNSF 310030_146290) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
