Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para mimetizar a entrada de produtos derivados de micróbios após rompimento da barreira intestinal.
Summary
Aqui apresenta-se um protocolo para imitar a entrada de compostos derivados de bactérias após a quebra da barreira intestinal. Um baixas doses subletais de lipopolissacarídeo foi injetado sistemicamente em ratos, que foram monitorados por injeção de pós 24h. Determinou-se a expressão de citocinas pró-inflamatórias em vários pontos de tempo no cólon, fígado e baço.
Abstract
A barreira epitelial intestinal separa o anfitrião da microbiota que normalmente é tolerada ou ignorada. A brecha desta barreira resulta na entrada de bactérias ou produtos derivados de bactérias no hospedeiro, acessando a circulação do hospedeiro e órgãos internos, levando à inflamação descontrolada, como observado em pacientes com doença inflamatória intestinal (IBD), que caracterizam-se por um aumento da permeabilidade epitelial intestinal.
Para simular a entrada de compostos derivados de bactérias para o host, um modelo de endotoxemia tem sido adotado em qual lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular externa de bactérias Gram-negativas, foram injetadas em ratos. Neste estudo, uma dose subletais de LPS intraperitonealmente foi injectada e os ratos foram monitorizados subsequentemente para 8 h, usando uma pontuação de doença. Além disso, a expressão de níveis das citocinas inflamatórias, Il6, Il1b e Tnfa foram analisados no baço, fígado e cólon por qPCR em pontos diferentes do tempo pós injeção de LPS. Este modelo pode ser útil para os estudos que envolvem a investigação de respostas imunes após a invasão de microorganismos ou produtos derivados de bacteriana causados por uma quebra de barreira de superfícies corporais.
Introduction
O intestino humano é colonizado com um grande consórcio de microorganismos que formam a microbiota, que desenvolveu um relacionamento mutuamente benéfico com o host durante a evolução. Nesta relação, o host fornece um nicho seguro para a microbiota, Considerando que a microbiota fornece vitaminas, digestão de nutrientes e proteção contra agentes patogénicos para o host, a microbiota reside1. Quando este relacionamento benéfico entre o host e a microbiota é perturbado, podem desenvolver doenças, tais como a doença inflamatória intestinal (IBD). IBD é uma doença inflamatória crônica multifatorial do intestino causada por fatores genéticos e ambientais que ocorrem em duas formas principais, (CD) de doença de Crohn e colite ulcerativa (UC). Apesar das semelhanças entre as duas formas de DII, caracterizam-se por certas diferenças na localização e natureza das modificações inflamatórias. CD é uma desordem inflamatória recidivante de transmural que potencialmente pode se estender a qualquer parte do tracto gastrointestinal, enquanto UC é não-transmural e é restrito para o cólon. Além disso, mutações no nucleotídeo oligomerização domínio-contendo proteína de ligação 2 (NOD2), um receptor de reconhecimento de padrão (PRR) que reconhece muramyl dipeptídeo (MDP), um componente da parede celular de bactérias gram-positivas mais – negativas, é associados ao CD2. Além disso, seus produtos, Listeria e estreptococos e Escherichia coli (e. coli)foram todos encontrados dentro de macrófagos em pacientes de CD que digitou o host depois que uma barreira romper3. Quando as bactérias ou seus produtos entram o hospedeiro durante o desenvolvimento do CD, o sistema imunológico desenvolve uma resposta levando à produção de anticorpos antibacteriano4de circulação. Talvez, a prova mais convincente para o papel da microbiota na patogênese da IBD decorre em modelos do rato. Quando os animais são tratados com antibióticos, ou quando os ratos são mantidos em condições de (GF) livre de germes, a severidade da doença é reduzida na maioria dos modelos de colite, tais como IL-10-/-ratos que não desenvolvem colite em GF instalações5,6. Além disso, a colite também perturba a composição da microbiota, que é caracterizado por uma composição desequilibrada e reduziu a riqueza chamada disbiose7. A consequência do IBD pode ser um aumento da permeabilidade intestinal que pode levar a entrada de micróbios e produtos derivados microbiana no hospedeiro.
Em animais, a aplicação de dextrano sulfato de sódio (DSS) induz uma violação epitelial intestinal, levando a um aumento da permeabilidade da barreira epitelial8. Concentrações de LPS portal são elevadas em animais com DSS colite9. Curiosamente, animais faltando o C tipo lectina receptor específico adesão intracelular molécula 3 agarrando nonintegrin relacionados ao homólogo 1 (sinal-R1) são protegidos de colite DSS e endotoxemia induzida por LPS10. Para mais divulgação no hospedeiro, bactérias ou produtos derivados de bactérias têm de passar a barreira vascular11, a cavidade peritoneal, onde se situam o intestino pequeno e grande porte, os linfonodos mesentéricos e/ou o fígado12. Para reduzir a complexidade deste sistema, utilizou-se um composto derivado de bacteriano definido. LPS, que faz com que a endotoxemia depois intraperitoneal (i.p.) ou intravenosa (i.v.) injeção13 foi injetado em ratos, para estudar a expressão das interleucinas Il6 e IIB e as citocinas Tnfa em resposta a LPS.
LPS é um patógeno associado molecular padrão (PAMP) expresso como um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, que consiste de lipídios A (a principal PAMP na estrutura dos LPS), um oligossacarídeo de núcleo e um O lado da cadeia14. Receptor tipo toll 4 (TLR4) expressado por células dendríticas, macrófagos e células epiteliais reconhece LPS15, que requer co-receptores para ligação apropriada. A fase aguda da proteína LPS-proteína (LBP) vincula LPS para formar um complexo que transfere LPS para o cluster de diferenciação 14 (CD14), uma proteína de membrana glicosilfostidilinosiol-ancorado. CD14 mais shuttles LPS de antígeno de linfócitos 96 ou também conhecido como MD-2, que está associada com o domínio extracelular de TLR4. A vinculação dos LPS para MD-2 facilita a dimerização do TLR4/MD-2 para induzir mudanças conformacionais moléculas intracelulares adaptador para ativar a jusante sinalização via14, que inclui a diferenciação mieloide primária de recrutar gene de resposta 88 (MyD88) – via dependente e a TIR domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF) – dependente da via16. O reconhecimento de LPS por TLR4 então ativa da via do NF-κB e induz a expressão de cytokines proinflammatory, como TNFa, IL-6 e IL-1 β17.
Em particular, quando LPS é injetado em animais, a concentração de LPS dado aos animais, o fundo genético do animal e a dieta tem de ser considerada. Altas concentrações de LPS leva a um choque séptico, caracterizado por hipotensão e várias falhas do órgão e finalmente a morte18. Ratos são menos sensíveis à LPS em comparação com os humanos, onde as concentrações de LPS entre 2-4 ng/kg de peso corporal (BW) são capazes de induzir uma tempestade de citocinas19. Para os ratos, a dose letal (DL50), que induz a morte em metade do varia de 10-25 mg/kg BW20 dependendo da estirpe de rato usado ratos. Para as cepas de rato comumente usados, C57Bl/6 e BALB/c, a dose letal 50% (DL50) é de 10 mg/kg BW. Em contraste, as estirpes C3H/HeJ e C57BL/10ScCr são protegidas de endotoxemia LPS induzidos, que é devido a mutações no Tlr421. Consequentemente, ratos Tlr4-deficientes são hiporeactividade para injeções com LPS22. Outras linhas de rato geneticamente modificado, como PARP1-/-ratos23 são resistentes ao choque tóxico induzida por LPS.
O modelo do mouse descrito aqui usa uma dose subletais de LPS administrado sistemicamente para imitar as consequências da divulgação de LPS, após uma quebra de barreira das superfícies do corpo. A concentração de LPS escolhida (2 mg/kg BW) não induzir a mortalidade em ratos C56Bl/6, mas a liberação induzida de citocinas pró-inflamatórias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo imita processos imunológicos que ocorrem após a invasão por produtos derivados microbiana. Passos críticos dentro do protocolo são a seleção de linha de rato, o estado de higiene dos ratos, a dose de LPS, o monitoramento dos animais para a ocorrência de endotoxemia e ponto de terminação de experimento de tempo. Mais importante ainda, o fundo genético da estirpe do mouse tem que ser considerado. Estirpes de mouse diferente têm diferente susceptibilidade à LPS. Por exemplo, o C3H/HeJ e camundong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Douglas é apoiada pela Fundação Nacional Suíço (SNSF 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
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