Här presenteras ett protokoll att efterlikna hänrycka av bakteriell-derived föreningar efter tarmbarriären brott. En låg subletala dos av lipopolysackarid injicerades systemiskt i möss, som övervakades under 24 h efter injektion. Uttrycket av pro-inflammatoriska cytokiner fastställdes vid flera tidpunkter i mjälten, levern och kolon.
Epitelial tarmbarriären separerar värden från den bakterieflora som normalt tolereras eller ignoreras. Brott mot denna barriär resulterar i ingången till bakterier eller bakterier-härledda produkter i den mottagande, tillgång till värd cirkulation och inre organ leder till okontrollerad inflammation som observerades hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), som kännetecknas av en ökad intestinal epitelial permeabilitet.
För att efterlikna hänrycka av bakteriell-derived föreningar i mottagande, en endotoxemia modell har antagits i som lipopolysackarid (LPS), en komponent i yttre cellväggen av gramnegativa bakterier, skulle injiceras i möss. I denna studie en subletala dos av LPS injicerades intraperitonealt och mössen var därefter övervakas för 8 h använder en sjukdom poäng. Dessutom uttrycket nivåer av det inflammatoriska cytokiner Il6, Il1b, och Tnfa analyserades i mjälten, levern och kolon av qPCR vid olika tidpunkter efter LPS injektionen. Denna modell kan vara användbar för de studier som omfattar utredning av immunsvar efter invasionen av mikroorganismer eller bakteriell-härledda produkter som orsakas av en barriär överträdelse av kroppens ytor.
Den mänskliga tarmen är koloniserade med ett stort konsortium av mikroorganismer som bildar den bakterieflora, som har utvecklat ett ömsesidigt givande förhållande med värden under utvecklingen. I denna relation ger värden ett säkert nisch för bakterieflora, medan bakterieflora ger vitaminer, näringsämnen matsmältning och skydd från patogener till värden, där bakterieflora finns1. När denna relation mellan mottagande och bakterieflora är störd, kan det framkalla sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). IBD är en multifaktoriell kronisk inflammatorisk sjukdom i tarmen orsakad av genetiska och miljömässiga faktorer som förekommer i två stora former, Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC). Trots likheterna mellan de två IBD-formerna kännetecknas de av vissa skillnader i läge och typ av inflammatoriska ändringar. CD är en skovvis transmural inflammatorisk sjukdom som potentiellt kan utöka till någon del av mag-tarmkanalen, medan UC är icke-transmural och är begränsad till tjocktarmen. Mutationer i nukleotid-bindande oligomerisering domän-innehållande protein 2 (NOD2), en mönster erkännande receptor (PRR) som känner igen muramyl dipeptid (MDP), en komponent i cellväggen hos de flesta grampositiva och -negativa bakterier, är dessutom associerade med CD2. Escherichia coli (E. coli), Listeria och streptokocker och deras produkter var alla fann dessutom inom makrofager i CD-patienter som har angett värden efter en barriär bryter mot3. När bakterier eller deras produkter anger värden under utvecklingen av CD, utvecklar immunförsvaret ett svar som leder till produktion av cirkulerande anti-bakteriell antikroppar4. Kanske härstammar mest övertygande bevisen för rollen som bakterieflora i patogenesen av IBD från musmodeller. När djur behandlas med antibiotika, eller när möss hålls i bakteriefria (GF) förhållanden, reduceras svårighetsgraden av sjukdomen i de flesta kolit modeller, såsom i IL-10-/-möss som inte utvecklar kolit i GF faciliteter5,6. Dessutom stör kolit också sammansättningen av den bakterieflora, vilket kännetecknas av en obalanserad sammansättning och kortare rikedom som kallas dysbios7. Följden av IBD kan vara en ökad intestinal permeabilitet som kan leda till ingången av mikrober och mikrobiella produkter i värden.
Djur inducerar ansökan av Dextran natriumsulfat (DSS) en intestinal epitelial överträdelse leder till en ökad permeabilitet av epiteliala barriären8. Portalen är LPS förhöjda hos djur med DSS kolit9. Intressant, skyddas djur saknar den C typ lektin receptor specifika intracellulära vidhäftning molekyl 3 greppa nonintegrin homolog-relaterade 1 (tecken-R1) från DSS kolit och LPS-inducerad endotoxemia10. För att ytterligare sprida in värden, måste bakterier eller bakterier härledda produkter passera den vaskulära hinder11, i bukhålan, där små och stora inälvan är belägen, mesenteriala lymfkörtlar och/eller lever12. För att minska komplexiteten i detta system, användes en definierad bakteriell-derived förening. LPS, som orsakar endotoxemia efter intraperitoneal (IP) eller intravenös (i.v.) injektion13 injicerades i möss, att studera uttrycket av interleukin Il6 och Ilb och cytokin Tnfa svar på LP-skivor.
LPS är en patogen-associerade molekylära mönster (PAMP) uttryckt som en cell-vägg komponent av gramnegativa bakterier, som består av lipid A (den huvudsakliga PAMP i strukturen av LPS), en core oligosaccharide och en O sida kedja14. Toll-like receptor 4 (TLR4) uttryckt av dendritiska celler, makrofager och epitelceller erkänner LPS15, som kräver samtidig receptorer för lämplig bindning. Den akuta fasen protein LPS-bindande protein (LBP) binder LPS bildar ett komplex som överför LPS i klustret av differentiering 14 (CD14), en glycosylphosphatidylinositol-förankrade membranprotein. CD14 ytterligare transferservice LPS till lymfocyter antigen 96 eller också känt som MD-2, som är associerad med det extracellulära området av TLR4. Bindningen av LPS till MD-2 underlättar dimerization TLR4/MD-2 att framkalla konfirmerande förändringar att rekrytera intracellulära adapter molekyler för att aktivera nedströms signalering väg14, vilket inkluderar den myeloida differentiering primärt svar gen 88 (MyD88) – beroende väg och av TIR-domän-innehållande adapter-inducerande interferon-β (TRIF) – beroende väg16. Erkännande av LPS av TLR4 sedan aktiverar NF-κB vägen och inducerar uttryck av proinflammatoriska cytokiner, såsom TNFα, IL-6 och IL-1β17.
I synnerhet när LPS injiceras i djur, koncentrationen av LPS ges till djuren, måste den genetiska bakgrunden av djuret och diet beaktas. Höga koncentrationer av LPS leder till en septisk chock, kännetecknas av hypotoni och flera organ misslyckanden, och slutligen till döden18. Möss är mindre känsliga för LPS jämfört med människor, där LPS koncentrationerna mellan 2-4 ng/kg kroppsvikt (BW) är kunna inducera en cytokin storm19. För möss, den dödliga dosen (LD50), som inducerar död i hälften av möss spänner från 10-25 mg/kg Kroppsvikt20 beroende på mus stammen används. För vanliga mus stammar, C57Bl/6 och BALB/c, är den dödliga dos 50% (LD50) 10 mg/kg Kroppsvikt. Däremot skyddas stammarna C3H/HeJ och C57BL/10ScCr från LPS framkallade endotoxemia, som beror på mutationer i Tlr421. Tlr4-brist möss är följaktligen hyporesponsiv till injektioner med LPS22. Andra genetiskt modifierade mus linjer, såsom PARP1-/-möss23 är resistenta mot LPS-inducerad giftet chockar.
Musmodell som beskrivs använder här en subletala dos av LPS administreras systemiskt för att efterlikna konsekvenserna av LPS spridning efter en barriär överträdelse av kroppens ytor. Den valda LPS koncentrationen (2 mg/kg BW) inducerade inte dödlighet i C56Bl/6 möss, men inducerad frigöraren av pro-inflammatoriska cytokiner.
Detta protokoll härmar immunologiska processer som inträffar efter invasionen av mikrobiella produkter. Kritiska steg inom protokollet är valet av raden mus, hygien status för mössen, dosen av LPS, övervakning av djuren för förekomsten av endotoxemia, och tidpunkten experiment uppsägning. Viktigast av allt, måste den genetiska bakgrunden av mus stammen beaktas. Annan mus stammar har olika känslighet för LPS. Exempelvis inducerad de C3H/HeJ och C57BL/10ScCr möss är resistenta mot LPS endotoxemia<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
JHN stöds av schweiziska National Foundation (SNSF 310030_146290).
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |