פרוטוקול לרכוש את Tenocyte ניוונית של בני אדם
Summary
השתמש במבחנה של tenocytes ניוונית חיוני כאשר החוקר את היעילות של טיפול חדשניים על tendinopathy. עם זאת, רוב המחקרים להשתמש רק את המודל החייתי או של tenocyte בריא. אנו מציעים הפרוטוקול. הבא כדי לבודד tenocytes ניוונית אנושי במהלך הניתוח.
Abstract
Tendinopathy, מצב כואב שמתפתח בתגובה ניוון בגיד, נמצאת בעלייה בעולם המפותח בשל הגדלת פעילות גופנית, תוחלת חיים ארוכה יותר. למרות השכיחות הגוברת שלה, המשמש כבסיס בפתוגנזה עדיין נשאר לא ברור, הטיפול הוא בדרך כלל סימפטומטי. לאחרונה, אפשרויות טיפוליות רבות, לרבות גורמי גדילה, תאי גזע, ריפוי גנטי, נחקרו בתקווה לשיפור את הפוטנציה הריפוי של הגיד ניוונית. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים אלו נערכו רק על מודלים בעלי חיים או tenocytes אדם בריא. למרות מחקרים באמצעות tenocytes פתולוגית, לפי מיטב ידיעתנו אין כרגע שום פרוטוקול המתאר כיצד ניתן להשיג את האדם tenocytes ניוונית. מטרת מחקר זה היא לתאר את פרוטוקול תקני לרכישת tenocytes ניוונית אנושי. בתחילה, הרקמה גיד היה נקצרו מחולה עם epicondylitis לרוחב במהלך הניתוח. אז נלקחו דגימות ביופסיה פושט carpi radialis הקצר הגיד המתאימים לשינויים מבניים ציין בזמנו של הניתוח. כל הגידים שנקטפו נראה משעמם, אפור, לעזאזל, בצקי, אשר הפך את אותם ויזואלית שונה מזו הבריאים. Tenocytes היו תרבותי ומשמשים לניסויים. בינתיים, מחצית הרקמות שנקטפו נותחו בהיסטולוגיה, זה הוצג כי הם חלקו את אותן תכונות מפתח של tendinopathy (angiofibroblastic דיספלזיה או היפרפלזיה). ניתוח משני מאת immunocytochemistry אישר כי התאים בתרבית היו tenocytes עם רוב התאים שיש כתמי חיובי המוהוק, tenomodulin חלבונים. האיכויות של הטבע ניוונית של tenocytes ואז נקבעו על-ידי השוואת התאים הפקד בריא שימוש assay התפשטות או לרביעיית-PCR. Tenocyte ניוונית מוצג שיעור גבוה יותר של התפשטות דפוסים דומים של ביטוי גנים של tendinopathy שתאמו את הדוחות הקודמים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה עשוי לספק כלי שימושי עבור מחקרים עתידיים של tendinopathy.
Introduction
Tendinopathy היא כרונית מצב של ניוון שרירים ושלד שמתפתח בחלקים שונים של הגוף. לאחרונה, מספר המקרים של tendinopathy גדל באופן משמעותי בעולם המפותח בשל גידול ההשתתפות ספורט ופנאי תוחלת החיים מוגברת1,2. הגורם tendinopathy נחשבת multifactorial, גורמים אלה כוללים איסכמיה, פציעות רדיקלים חופשיים של חמצן, חוסר איזון בין מצר את כלי הדם, מרחיב כלי דם innervations, מיקרו פנימי-דמעות, ושינויים נוירו-תקנה3 ,4,5,6,7,8. רוב הטיפולים עבור tendinopathy רק להקל על הסימפטומים שלה. יתר על כן, טיפולים ללא התחדשות רקמות דורשים זמן רב לשיקום ולהשיג לתגובה מוגבלת של הגידים פצוע, שהטילו אתגר קליני עבור רופאים9.
היכולת של אפשרויות הטיפול הנוכחי יחד עם חוסר היכולת של הגיד ניווניות self-heal יש חוקרים עופרת להתעניין לחקור אסטרטגיות טיפול אלטרנטיבי. לאחרונה, מחקרים חדשים דיווחו על תוצאות מבטיחות רבות לשיפור יעילות הריפוי של הגידים tendinopathy באמצעות גורמי גדילה, תאי הגזע מבוסס טיפול וג’ין טיפול10,11,12.
באמצעות ביקורת ספרות, מצאנו כי המחקרים מעורב ניתן לחלק לשתי קטגוריות מבוסס על חומרים ניתוח שלהם: חיה דגמים כמו חולדה, עכבר או ארנב; לדוגמניות אנושיות. לגבי המודל בעלי חיים, כיום ישנם שתי שיטות פופולרי כדי להפיק tendinopathy: אינדוקציה כימי של פציעה או מכונות העמסת המודל. עם זאת, כל דגם בעלי חיים היה מוגבל מתרבה tendinopathy האנושית מורכבת פתולוגיה13,14.
רוב המסמכים באמצעות דגימות האנושי נותחו בהיסטולוגיה או ביצע את במבחנה הניסוי המבוסס על tenocyte אנושי בריא ולא ניוון tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. רק על כמה מסמכים דיווחו כי הם השתמשו tenocyte ניוונית של האדם, אך הם לא מתארים בפרוטרוט את פרוטוקול המשמש כדי לקבל את tenocyte ניוונית מ האנושי22,23. בהקשר זה יצוין כי תוצאות מוצלחות מן המודל בעלי חיים או את הרקמות/tenocyte בריא מאי לא בהכרח לנבא את היעילות האנושית או מינון אפקטיבי כי ניוון בגיד הוא תהליך מסובך והוא בפתוגנזה עדיין לא לגמרי מובן.
באופן קולקטיבי, זה הכרחי לתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי להשגת את tenocyte ניוונית של רקמה אנושית מבלי לגרום תופעות לוואי על התורם. מאמר זה מתאר פרוטוקול על איך לרכוש את tenocyte ניוונית אנושי. כדי לאמת את הפרוטוקול, נותחו בהיסטולוגיה הרקמות שנקטפו. לאחר מכן, לתא בתרבית אושר כמו tenocyte ניוונית באמצעות immunocytochemistry (ICC), של כמותיים בזמן אמת-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ואת וזמינותו של הכדאיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר מחקרים קודמים דיווחו על איך ליצור מודלים בעלי חיים tendinopathic כרונית, באמצעות הליכים שונים כגון collagenase או הזרקת kartogenin, הליכון ריצה26,עוד27. למרות מחקרים רבים הראו מבטיחים אפקטים טיפולית המבוססת על מודלים בבעלי חיים אלה, ניסויים באמצעות את tenocyte ניוונית האנוש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר מומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI16C1559).
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes’ patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), 1359-1360 (2009).
