Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências
Summary
Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.
Abstract
Em inúmeros contextos biológicos, células animais precisam interagir fisicamente com o seu ambiente através do desenvolvimento de forças mecânicas. Entre estes, as forças de tração foram bem caracterizadas, mas há uma falta de técnicas que permite a medição de protrusão forças exercidas pelas células ortogonalmente à sua carcaça. Nós projetamos uma instalação experimental para medir as forças de protrusão exercidas pelas células aderentes em sua carcaça. Células banhadas em uma folha de Formvar compatível com deformam o substrato e a topografia resultante é mapeada por microscopia de força atômica (AFM) à escala nanométrica. Valores de força então são extraídos de uma análise do perfil deformação baseado na geometria das estruturas celulares cêntrica. Portanto, as forças exercidas pelas unidades individuais salientes de uma célula viva podem ser medidas ao longo do tempo. Esta técnica permitirá que o estudo da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão. Aqui, descrevemos o seu aplicativo para medir as forças cêntrica geradas por podosomes formado por macrófagos humanos.
Introduction
As células animais interagirem fisicamente com a matriz e as outras células que constituem o seu ambiente1. Isso é necessário para que eles migram, internalizar os corpos, adquirir informações externas ou diferenciar. Em tais processos, a célula deve gerar forças mecânicas e, como numerosos estudos têm demonstrado ao longo dos últimos anos, a capacidade de uma célula para gerar forças e sonda ambiente influencia seu comportamento biológico, dirigindo por exemplo proliferação ou diferenciação de2,3. Por sua vez, a medição de forças celulares é uma grande ajuda para estudar o Regulamento de geração de força e entender a sua implicação na célula destino4,comportamento e tecido5.
Últimos anos têm testemunhado o desenvolvimento de inúmeras técnicas para medir as forças que uma célula pode exercer sobre seu ambiente6. A maioria destes têm sido fundamentais para revelar que a tração forças que células exercem como eles puxam em sondas móveis ou um substrato deformável. No entanto, as forças mecânicas envolvidas em protrusão no ambiente extracelular sofrem com a falta de técnicas de medição e são até à data não bem caracterizada.
Para contornar essa limitação, apresentamos um método para medir forças exercidas ortogonalmente ao substrato. Ela consiste no chapeamento de células vivas em uma folha fina e elástica que pode deformar-se na direção ortogonal, tornando possível medir a deformação do substrato pelas células e deduzir as forças envolvidas. Topografia de substrato é medida com resolução nanoescala usando microscopia de força atômica e a avaliação das forças de deformação baseia-se no conhecimento da geometria do cêntrica estruturas celulares7,8, 9.
Aqui, descrevemos a configuração e a sua aplicação para medir as forças geradas pela podosomes, estruturas de adesão cêntrica formadas por macrófagos para sua migração mesenquimal em ambientes tridimensionais10,11, 12,13,14,15,16,17. Acreditamos que esta técnica vai avançar a compreensão da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Propriedades do material
A escolha do material para a membrana deformável, no nosso caso Formvar, precisa cumprir alguns requisitos. O material deve ser transparente à luz visível e apresentam fluorescência auto limitada para permitir as observações em campo claro e microscopia de fluorescência. A rugosidade do filme fino deve estar abaixo de 10 nm para evitar qualquer efeito topográfico na adesão celular e para permitir a observação clara das saliências induzida p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Anna Labernadie, Guillaume Charrière e Patrick Delobelle pela sua contribuição inicial para este trabalho e Matthieu Sanchez e Françoise Viala por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo. Este trabalho tem sido apoiado pela L’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la de derramar Fondation de la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM plano de câncer, câncer de Toulouse Fondation e humano Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
