Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren
Summary
Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.
Abstract
In zahlreichen biologischen zusammenhängen müssen tierische Zellen physisch mit ihrer Umgebung interagieren durch mechanische Kräfte zu entwickeln. Unter diesen Zugkräfte gut charakterisierten gewesen, aber es fehlt an Techniken ermöglichen die Messung der Kräfte, Vorsprung durch Zellen orthogonal zu ihrem Substrat. Wir entwarfen eine Versuchsanordnung, die Kräfte, Vorsprung durch adhärente Zellen auf ihrem Substrat zu messen. Zellen, die auf einem kompatiblen Formvar Blatt vergoldet verformen dieses Substrat und die daraus resultierende Topographie wird durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf der Nanometerskala zugeordnet. Kraftwerte werden dann von einer Analyse der Verformung Profil basierend auf der Geometrie der hervorstehende zellulären Strukturen extrahiert. Daher können die Kräfte, die von den einzelnen hervorstehenden Einheiten einer lebenden Zelle im Laufe der Zeit gemessen werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung. Hier beschreiben wir ihre Anwendung auf die hervorstehende Kräfte erzeugte Podosomes gebildet durch menschliche Makrophagen zu messen.
Introduction
Tierische Zellen interagieren körperlich mit der Matrix und den anderen Zellen, die ihre Umwelt1darstellen. Dies ist erforderlich für sie zu migrieren, Körper zu verinnerlichen, externe Informationen zu erwerben oder zu unterscheiden. In solchen Prozessen muss die Zelle mechanische Kräfte erzeugen, und wie in den letzten Jahren zahlreiche Studien gezeigt haben, beeinflusst die Fähigkeit einer Zelle zu erzeugen Kräfte und seiner Umgebung Sonde sein biologische Verhalten, Regie zum Beispiel Verbreitung oder Differenzierung-2,–3. Die Messung von zellulären Kräften ist wiederum eine große Hilfe für die Regulierung der Truppenaufstellung zu studieren und verstehen seine Auswirkung in Zelle Verhalten und Gewebe Schicksal4,5.
Den letzten Jahren erlebt haben die Entwicklung von zahlreichen Techniken, um die Kräfte zu messen, die eine Zelle auf seine Umwelt6ausüben kann. Die meisten davon haben maßgeblich bei der Enthüllung, dass die Traktion erzwingt, dass Zellen ausüben, wie sie auf mobile Sonden oder einem verformbaren Untergrund ziehen. Jedoch die mechanischen Kräfte beteiligt Vorwölbung in die extrazellulären Umwelt leiden unter einem Mangel an Messtechniken und sind bis heute nicht gut charakterisiert.
Um diese Einschränkung zu umgehen, stellen wir Ihnen eine Methode zur Messung der Kräfte, die orthogonal zum Substrat. Es besteht in der Beschichtung von lebenden Zellen auf eine dünne elastische Folie, die in Richtung orthogonal, die es ermöglichen, Substrat Verformung von Zellen zu messen und daraus die beteiligten Kräfte verformen kann. Substrat Topographie mit nanoskaligen Auflösung mit Rasterkraftmikroskopie gemessen und die Bewertung der Kräfte von Verformung stützt sich auf das Wissen um die Geometrie der hervorstehende Zellstrukturen7,8, 9.
Hier beschreiben wir die Einrichtung und ihre Anwendung auf die erzeugte Podosomes, hervorstehende Adhäsion Strukturen gebildet durch Makrophagen für ihre mesenchymalen Migration in dreidimensionalen Umgebungen10,11Kräfte zu messen, 12,13,14,15,16,17. Wir glauben, dass diese Technik die Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung verstehen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Materialeigenschaften
Die Wahl des Materials für die verformbare Membran, in unserem Fall Formvar, muss einige Voraussetzungen erfüllen. Das Material muss für sichtbares Licht transparent sein und weisen begrenzt Auto-Fluoreszenz um Beobachtungen im Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben. Die Rauheit des dünnen Films muss deutlich unter 10 nm eine topographische Beeinträchtigung Zelladhäsion zu vermeiden und klare Betrachtung der Zelle-induzierte Vorsprünge von A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar, Anna Labernadie, Guillaume Charrière und Patrick Delobelle für ihren ersten Beitrag zu dieser Arbeit und Matthieu Sanchez und Françoise Viala für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt. Diese Arbeit wurde von l ‘ Agence Nationale De La Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation Pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planen Krebs, Fondation Toulouse Krebs und Human Frontier Science Program (RGP0035/2016) unterstützt.
Materials
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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