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Medicine

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57637
, ,
1Department of Biochemistry, School of Medicine,Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology,Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children’s Hospital,University Hospitals, Cleveland

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à développer et caractériser les cellules dendritiques tolérogène (TolDCs) et évaluer leur utilité immunothérapeutique.

Abstract

Le système immunitaire fonctionne en maintenant un équilibre serré entre la coordination des réponses contre les antigènes étrangers et maintenir un État ne répondant pas contre des auto-antigènes comme antigènes dérivés d’organismes commensaux. La perturbation de cette homéostasie immunitaire peut entraîner une inflammation chronique et le développement de l’auto-immunité. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigène professionnelles du système immunitaire inné impliqué dans l’activation des cellules naïves T pour initier des réponses immunitaires contre les antigènes étrangers. Cependant, DCs peuvent également être différenciés dans les TolDCs qui agissent pour maintenir et promouvoir la tolérance des lymphocytes T et de supprimer les cellules effectrices qui contribuent au développement des deux conditions d’inflammation auto-immune ou chronique. Le récent progrès dans notre compréhension de TolDCs suggère que DC tolérance peut être réalisée en modulant leurs conditions de différenciation. Ce phénomène a entraîné une croissance considérable dans le développement de thérapies TolDC de nombreux désordres du système immunitaire causées à rompre dans la tolérance immunitaire. Des études dans les modèles murins auto-immunité précliniques ont validé davantage l’immunothérapie utilité de TolDCs dans le traitement des maladies auto-immunes. Aujourd’hui, les TolDCs sont devenus un outil prometteur immunothérapeutique dans la clinique de rétablissement tolérance immunitaire dans divers troubles immunitaires en ciblant les réponses auto-immunes pathogènes tout en conservant l’immunité protectrice intactes. Bien qu’un éventail de stratégies a été proposée par plusieurs laboratoires pour induire la TolDCs, il n’y a aucune cohérence pour caractériser le phénotype cellulaire et fonctionnel de ces cellules. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour le développement de la moelle osseuse DCs en grand nombre, une méthode unique permettant de les différencier en TolDCs avec un 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic de triterpénoïdes synthétique difluoro-propyl-amide de l’acide (CDDO-Division) et les techniques utilisées pour confirmer leur phénotype, y compris les analyses des signatures moléculaires essentielles de TolDCs. Enfin, nous montrons une méthode pour évaluer la fonction TolDC en testant leur réponse immunosuppressive in vitro et in vivo dans un modèle préclinique de sclérose en plaques.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) font partie intégrante du système immunitaire inné et ont d’abord découvert et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 comme cellules présentatrices d’antigène professionnelle primaire1. DCs ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’activation immunitaire en présentant des antigènes transformés à cellules T et cellules B via des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) dans les organes lymphoïdes secondaires pour relier le système immunitaire inné et adaptatif2. Dans le système immunitaire des mammifères, il y a au moins deux catégories de contrôleurs de domaine qui ont été décrits comme myéloïde DCs et plasmacytoides des contrôleurs de domaine (PDC)3. DCs myéloïdes, aussi connus comme le DCs classiques (CDC), sont caractérisées par l’expression de CD11c et peuvent être différenciées comme immatures DCs (iDCs) in vitro de cellules souches de moelle osseuse ou les monocytes du sang périphérique à l’aide granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4 espèces murines ou humaines, respectivement4.

Activation de « danger » de signaux, tels que les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés (PAMP) ou profils moléculaires associés aux dommages (DAMP), conduira la maturation iDCs vers DCs immunogènes comme matures DCs (CAM) via liaison différents récepteurs de reconnaissance de modèle la surface DC5. Immunogènes DCs plus amorcer la prolifération des lymphocytes T naïfs et la différenciation par le biais de l’augmentation de MHCII2, ligands costimulation (CD80, CD86, CD40 et)6, cytokines et autres médiateurs solubles7. Une cascade de production pro-inflammatoire médiateur de DCs immunogène est essentielle pour la différenciation des cellules de T médiée par les cytokines. Par exemple, tant IL-12 et IFN-γ sont nécessaires pour de différenciation Th18 et IL-1, IL-6 et IL-23 sont essentiels pour naïve des lymphocytes T polarisation vers de cellules Th179. Bien que matures DCs réagissent aux antigènes étrangers, activation incontrôlée de DC par auto-antigènes susceptible d’entraîner l’ablation de tolérance et favorisent le développement de maladies auto-immunes en générant des cellules autoréactives T dont l’activation mène à la destruction des tissus10 .

Des rapports récents ont fourni une preuve claire de la plasticité de DC, témoigne de leur capacité à interagir avec différents repères au sein de leur microenvironnement de tissu et à se différencier en sous-ensembles distincts effecteur/suppresseur DC. Les médiateurs anti-inflammatoires, comme l’IL-10,11, TGF-β12et13 de la HO-1 ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’immunosuppression en induisant tolérogène DCs (TolDCs). Ces TolDCs acquérir des fonctions régulatrices et supprimer la prolifération de lymphocytes T14. En outre, l’absence de Co-stimulation par DCs la production de médiateurs anti-inflammatoires de TolDCs contribuent à l’induction des cellules T régulatrices (Tregs) et aussi efficacement inhibe la différenciation et l’expansion des Th1 et Th1715. Dans passé deux décennies, le potentiel thérapeutique des TolDCs a été rapporté par plusieurs chercheurs. Dans ces études, l’administration de l’ex-vivo généré TolDCs non seulement amélioré les symptômes pathologiques dans différents modèles précliniques de maladies auto-immunes16 mais aussi conduit au développement d’une tolérance immunitaire chez les patients17 ,,18. Fait intéressant, aujourd’hui la thérapie TolDCs a été considérée comme une approche alternative ou complémentaire pour des maladies auto-immunes dans plusieurs essais cliniques, y compris de type 1 diabète sucré19, polyarthrite rhumatoïde,20, 21, sclérose en plaques (MS)22,23,24et de la maladie de Crohn25.

Il existe une variété de protocoles qui ont été employés pour développer TolDCs et plusieurs laboratoires ont signalé des méthodes pour la production et la caractérisation phénotypique de TolDCs. Ces méthodes peuvent être utilisées de façon reproductible générer TolDCs in vitro de progéniteurs hématopoïétiques et de les maintenir stablement dans un état in vivode la tolérogène26,27,28,29. L’iDCs peut être converti en TolDCs par l’exposition à divers agents pharmacologiques immunomodulateurs ou cytokines anti-inflammatoires. Par exemple, la vitamine D3 est un agent pharmacologique bien connu connu pour augmenter la production d’IL-10 et de supprimer la sécrétion d’IL-12 de contrôleurs de domaine et d’accroître ainsi leur fonction immunosuppressive30. En outre, lorsque les contrôleurs de domaine sont exposés à des stimuli inflammatoires puissants, tels que les lipopolysaccharides (LPS), plusieurs agents pharmacologiques telles que dexaméthasone31et32de la rapamycine corticostéroïdes33 ont démontré qu’induisent les Phénotype TolDC en réduisant l’expression de CD40, CD80, CD86 et MHCII34DC en surface. IL-10 et TGF-β sont les cytokines anti-inflammatoires plus étudié pour induire la tolérance de DC35 et l’exposition simultanée à la fois de ces cytokines auraient dû être divulgués pour induire un phénotype tolérogène dans DCs36.

Depuis le tolérogène que DC est défini par des caractéristiques fonctionnelles plutôt que par des marqueurs phénotypiques, il y a un grand besoin d’élaborer une méthode cohérente pour la caractérisation fonctionnelle et cellulaire des TolDCs. En outre, un protocole rigoureux et cohérent doit être établi d’évaluation cohérents et de caractérisation du phénotype tolérogène DC si l’on veut efficacement et de façon reproductible comparer la capacité des nouveaux agents d’induire le phénotype TolDC dans la laboratoire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé avec les méthodes étape par étape pour isoler les pays en développement insulaires de progéniteurs hématopoïétiques de souris et d’analyser par la suite l’efficacité d’un nouvel agent en cours d’évaluation pour leur capacité à convertir des pays en développement insulaires en TolDCs, fournissant une robuste caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TolDCs in vitro et in vivo. Cette description inclut une méthode élaborée pour caractériser la TolDCs de leurs ligands surfaces, profil des cytokines et fonctions immunosuppressive in vitro. Nous fournissons également un exemple d’une méthode pour étudier l’application thérapeutique potentielle de ces TolDCs dans un modèle préclinique de MS, encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Ce protocole établi aide les chercheurs à évaluer la capacité des nouveaux agents pour promouvoir l’induction de TolDCs et facilitera les efforts visant à élargir le champ de développement thérapeutique TolDC.

Protocol

Toutes les études ont été effectuées conformément aux procédures approuvées de la Case Western Reserve University School of Medicine animalier institutionnel et Comité d’urbanisme. 1. préparer la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs) Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées. Euthanasier souris C57BL/6 8-10 semain…

Representative Results

La différenciation et la sélection de BMDCs : Cellules souches de la moelle osseuse ont été cultivés en milieu RPMI complet en présence de GM-CSF et d’IL-4 à se différencier en pays en développement insulaires pendant 7 jours (Figure 1 a). Jour 1, les cellules ont de petite taille et morphologie sphérique. Laver avec du PBS avant le remplacement du milieu frais le jour …

Discussion

Cet article décrit un protocole efficace qui peut être utilisé pour reproductible pour générer des pays en développement insulaires et à les différencier par la suite dans TolDCs, et nous proposons que cela peut servir à évaluer la capacité des nouveaux agents de la cible moléculaire pour induire la TolDC phénotype. Comme décrit dans le présent rapport, nous avons suivi une séquence dans laquelle nous avons tout d’abord analysé TolDC expression de ligands surfaces par cytométrie en flux, suivie d’un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Reata Pharmaceuticals pour la fourniture de CDDO-Division. Nous reconnaissons également l’appui de la Jane et Lee Seidman Chaire Innovation de Cancer pédiatrique (John Letterio). Ce travail a été soutenu par le ministère de la défense [W81XWH-12-1-0452] ; l’Initiative de recherche Cancer adultes Angie Fowler adolescents et les jeunes au cas Comprehensive Cancer Center ; et le diplômé Callahan Scholar Award pour Wei Hsi-Ju de F.J. Callahan Foundation.

Materials

CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry
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References

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Wei, H., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).
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