Induktion av nefrotiskt syndrom hos möss av retrobulbär injektion av Doxorubicin och förebyggande av volym lagring genom frisättningen Aprotinin
Summary
Här, beskriver vi induktion av experimentella nefrotiskt syndrom i 129S1/SvImJ möss genom snabba retrobulbär injektion av doxorubicin. Vi behandlar också nefrotiskt möss med fördröjd frisättning pellets som innehåller aprotinin hämma urin serin proteas aktivitet och förhindra natriumretention.
Abstract
Nefrotiskt syndrom är den mest extrema manifestationen av proteinuric njursjukdom och kännetecknas av tung proteinuri, hypoalbuminemi och ödem på grund av natriumretention och hyperlipidemi. För att studera patofysiologin av detta syndrom, baserat gnagare modeller har utvecklats på injektion av giftiga ämnen såsom doxorubicin orsaka podocyte skada. Hos möss är endast några stammar mottagliga för denna modell. I vildtyp 129S1/SvImJ möss inducerar administrationen av doxorubicin som snabb intravenös injektion till retrobulbär sinus experimentella nefrotiskt syndrom som har alla symptom på mänskliga sjukdomar inklusive natriumretention och ödem. Efter uppkomsten av proteinuri ökad möss uppvisar urin serin proteas aktivitet som leder till aktivering av epitelial natrium kanal (ENaC) och natriumretention. Farmakologisk hämning av urin serine proteaser genom behandling med fördröjd frisättning aprotinin upphäver ENaC aktivering och förhindrar natriumretention. Denna modell är perfekt att studera patofysiologin av proteasuria, dvs., utsöndring av aktiva serine proteaser som orsakar ENaC aktivering genom proteolys av dess γ-subenhet. Detta kan betraktas som den primära mekanismen av ENaC aktivering och natriumretention i proteinuric njursjukdom.
Introduction
Nefrotiskt syndrom kännetecknas av tung proteinuri, hypoalbuminemi, ödem och hyperlipidemi, och kan betraktas som den mest extrema manifestationen av proteinuric njursjukdom. Hos gnagare, kan experimentell nefrotiskt syndrom induceras av injektion av antracykliner eller puromycin som leder till podocyte skador och liknar mänskliga minimal förändring sjukdom och fokal segmentell glomeruloskleros (FSGS)1. Efter dess första Beskrivning 1955 av Frenk et al. 2, puromycin nukleosid nefros (PAN) hos råttor har blivit en standard modell att undersöka patofysiologin av nefrotiskt syndrom i många studier3,4,5,6. Hos möss, kan motsvarande modell induceras av antracyklin doxorubicin7. Det finns dock en stark stam-beroende som bestäms genetiskt av minst två genregioner8. Dessutom finns det skillnader i proteinuric svar och kursen av nefrotiskt syndrom9,10. Proteinuri svaren med 129S1/SvImJ möss och snabb intravenös injektion av doxorubicin via retrobulbär sinus, och når värden som är tillräckliga för att framkalla typiskt för nefrotiskt syndrom, särskilt volym lagring kännetecknas av ascites och nästan natriumfritt urin7. Natriumretention i experimentell nefrotiskt syndrom har varit antas vara resultatet av aktiveringen av epitelial natrium kanal (ENaC) i den distala tubuli av aberrantly filtrerade serine proteaser såsom plasmin orsakar proteolys av dess γ-subunit4 ,11,12. Nyligen bevisades detta koncept i nefrotiskt möss som skyddades från proteolytiska ENaC aktivering och natriumretention genom behandling med serin proteas hämmare aprotinin som var lika effektivt som de ENaC blockerare amilorid13. För att säkerställa kontinuerlig leverans till den distala tubuli, gavs aprotinin via subkutant implanterad frisättningen pellets. Framtida studier krävs för att identifiera de serine proteaser som ansvarar för proteolytiska ENaC aktivering i nefrotiskt syndrom som tros parallellt den mänskliga situationen. För detta ändamål är doxorubicin-inducerad nefrotiskt syndrom en värdefull modell som kan användas i vildtyp möss eller expanderat till genetiskt modifierade möss. Systemets fördelar omfattar låg kostnad av drogen, lägre komplexitet hantering och bra reproducerbarhet14.
I denna artikel visar vi induktion av experimentella nefrotiskt syndrom genom snabb intravenös injektion av doxorubicin till retrobulbär sinus och implantation av sustained release pellets som innehåller aprotinin för att hämma urin serinproteas aktivitet mätt med en kromogenanalysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi att doxorubicin injektion via retrobulbär sinus injektion inducerar experimentella nefrotiskt syndrom i 129S1/SvImJ möss med proteinuri, natriumretention, hypoalbumenia och hyperlipidemi. Det finns dock två viktiga frågor som måste beaktas när du använder denna modell. Första modell med induktion är strikt dosberoende och avvikelser av doxorubicin dos så liten som 0.3 µg/g påverka svaret av möss15. När injiceras med en lägre dos som 14 µg/g kroppsvikt eller nedan, dox…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av ett bidrag från den tyska forskningsfondens (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL – 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15×25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
