Visualisering af Amyloid β indskud i den menneskelige hjerne med Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation Imaging massespektrometri

Summary

Molekylær billeddannelse med matrix assisted laser desorption/Ionisation-baseret tænkelig massespektrometri (MALDI-IMS) tillader den samtidige kortlægning af flere analysander i biologiske prøver. Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og visualisering af amyloid β protein på hjernen væv af Alzheimers sygdom og cerebral amyloid angiopathie prøver ved hjælp af MALDI-IMS.

Abstract

Neuropatologiske af Alzheimers sygdom (AD) er kendetegnet ved ophobning og sammenlægning af amyloid β (Aβ) peptider i ekstracellulær plaques i hjernen. Aβ peptider, bestående af 40 aminosyrer, der genereres fra amyloid forløber protein (APP) af β – og γ-secretases. Aβ er deponeret i cerebral parenkym, men også i leptomeningeal og cerebral fartøj vægge, kendt som cerebral amyloid angiopathie (CAA). Mens en række Aβ peptider blev identificeret, detaljerede produktion og distribution af individuelle Aβ peptider i patologisk væv af AD og CAA har ikke været behandlet fuldt ud. Her, udvikler vi en protokol i matrix assisted laser desorption/Ionisation-baseret tænkelig massespektrometri (MALDI-IMS) på menneskelige obduktion hjernen væv at opnå omfattende protein kortlægning. Til dette formål, blev menneskelige kortikale prøver indhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute i gerontologi. Frosne snit frosset organmateriale er skåret og overført til indium-tin-oxid (ITO)-belagt glas lysbilleder. Spectra er erhvervet ved hjælp af MALDI system med en rumlig opløsning op til 20 µm. Sinapinic syre (SA) lejrer ensartet på dias ved hjælp af enten en automatisk eller en manuel sprøjte. Med de nuværende tekniske fordele MALDI-IMS, kan en typisk data sæt af forskellige Aβ arter inden for de samme dele af menneskelige autopsied hjerner opnås uden specifikke prober. Desuden, høj opløsning (20 µm) billeddannelse af en annonce hjernen og svær CAA prøven viser tydeligt, at Aβ1-36 til Aβ1-41 blev deponeret i leptomeningeal fartøjer, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 blev deponeret i cerebral parenkym som senil plaque (SP). Det er muligt at vedtage MALDI-IMS som en standard metode i kombination med kliniske, genetiske og patologiske observationer i forståelsen af patologi af annonce, CAA, og andre neurologiske sygdomme baseret på den nuværende strategi.

Introduction

For at stille diagnosen og forstå patogenesen af neurodegenerative sygdomme, er præcise molekylære identifikation af patologiske indskud væsentlige¹. I løbet af annonce, Aβ er produceret for at gøre enkeltbetalingsordningen i de cerebrale parenkym og deponeres i fartøjer længe før sygdom udbrud^2,3,4,5,6. Mens Aβ1-42 er den fremherskende peptid i SP af annonce hjerner, andre Aβ varianter, som N-terminal eller C-terminale afkortet eller ændret Aβs, er også identificeret i berørte AD hjerner^{7,8,9, 10}. Et fuldstændigt billede af den brede vifte af Aβ arter i menneskers hjerner, især med AD og cerebral amyloid angiopathie (CAA)¹¹, vil hjælpe forskerne forstå Aβ produktion, stofskifte og deposition.

Som den klassiske tilgang af neuropatologiske, har Immunhistokemi (IHC) været den mest afgørende metode til at bestemme placeringen af Aβs i hjernen væv^12,13,14,15. I almindelighed, IHC kan ikke skelne mellem molekyler når flere epitoper eksistere samtidigt. Derimod er en spirende massespektrometri-baseret proteom-analyse en værdifuld fremgangsmåde især til at analysere en bred vifte af Aβ arter i hjernen væv, som ikke kan differentieres med antistoffer^16,17. Den konventionelle massespektrometri-baseret analyse af hjernen lysates og immuno-udfældet prøver ikke at afsløre mindre Aβ peptider og mister distributionsoplysninger af Aβ i hjernevæv.

I tidligere værker er visualisere Aβ indskud i mus hjerner lykkedes ved hjælp af transgene dyr model af annonce, for eksempel APP23. Denne proces skal dog stadig tekniske fremskridt at sammenligne IMS og IHC med hensyn til opløsning og følsomhed^18,19,20. Annonce neuropatologiske bør undersøges på menneskers hjerner, og vi brugte MALDI-IMS teknologi på menneskelige obduktion hjernen væv for at opnå omfattende protein kortlægning²¹. Til dette formål udviklede vi en protokol til en avanceret type af massespektrometri, som har fordele i dens hurtighed, følsomhed og reproducerbarhed.

Protocol

Her, blev vævsprøver indsamlet på Tokyo Metropolitan geriatriske Hospital, som giver EF-baserede lægelige ydelser til den ældre del af befolkningen i Japan. Hjernen obduktion prøver, der indgår i undersøgelsen var registreret til hjernen banken for Aging Research (BBAR) med informeret samtykke fra afdødes pårørende. BBAR er godkendt af den etiske komité i Tokyo Metropolitan geriatriske Hospital og Institut for gerontologi. For alle hjerner registreret på hjernen bank, opnåede vi skriftlig informeret samtykke til brug for medicinsk forskning fra patienter eller deres familier. Patienterne blev placeret i et koldt (4 ° C) i 2 h efter døden for at reducere postmortem ændringer i hjernen. Alle metoder beskrevet her er godkendt af Doshisha Universitet og hjernen Bank for Aging Research, Tokyo Metropolitan geriatriske Hospital og Institut for gerontologi. 1. forberedelse af væv sektioner for IMS Forarbejdning væv eksemplar af en menneskelig autopsied hjerneBemærk: Sikre at prøve præparationstrin for IMS bevarer den oprindelige tilstand af væv. Undgå forurening og post mortem-ændringer. De følgende trin er afgørende. Få menneskelige kortikale prøver for IMS fra hjernen, der blev fjernet, behandles og opbevares ved-80 ° C inden for 8 h obduktion. Tage hjerne model fra occipital cortex af AD patienter og alder-matchede kontrol21. Forberedelse af frossen væv sektioner Skær væv sektioner på en kryostaten. Placer ledende ITO-belagt glas objektglas inde kryostaten21. Varm obduktion hjerne model fra-80 ° C til 22 ° C inde kryostaterne. Knytte en ny engangs klinge til kryostaterne til hvert eksperiment. Altid forsøge at bruge en ren del af vingen. Sætte frosne obduktion hjerner på scenen sammen med en lille mængde af OCT sammensatte (nok til at dække det centrale område af etape; Se Tabel af materialer). Vælg betingelserne for tynde skæring. For IMS, skal du bruge en tykkelse på 10 – 12 μm for menneskelige hjerne sektioner. For IMS og IHC, skær fem til seks sektioner fra hver vævsprøve. Når bladet er begyndt at skære væv, drej hjulet og “ansigt” blokken indtil alle af væv er udsat. Hvis der er en lille stribe eller rive hele afsnittet, vente lidt mere i kryostaterne indtil temperatur tilpasning automatisk løser det. Tæller et par sekunder før du åbner anti-rullen med en væv nedenunder. Umiddelbart Placer væv skive i ITO-coatede side af glas dias. Tø væv udsnittet ved at sætte en finger nedenunder diaset på den ikke-ITO-belagt side. Vævet vil holde sig til diasset; sikre at vævet er så fladt som muligt med ingen rynker. Udføre dette trin ved stuetemperatur.Bemærk: Bære handsker, masker og et laboratorium kjole, fordi de menneskelige prøver må indeholde biologiske kontaminanter. Når alle dele har foretaget for dagen, ren kryostaten, pensler og chucks med laboratoriet klude og 200 mL 100% ethanol. Skylning afsnittene væv Fordyb prøver i 40 – 100 mL af 70% ethanol til 30 s til at fjerne endogene lipider og uorganiske salte. Bruge et glas farvning krukke. Vaske prøver med 40-100 mL 100% ethanol til 30 s, 40-100 mL af Carnoys løsning til 3 min., 40-100 mL 100% ethanol til 30 s, 40-100 mL af 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) for 1 min og 40-100 mL 100% ethanol til 30 s. Brug et glas farvning krukke.Bemærk: Carnoys løsning er fiksativ består af seks dele ethanol, tre dele eddikesyre og en del chloroform. Tør i et vakuum i 30 min. Behandling af sektionerne væv med en myresyre vapor for en bedre ionisering af Aβ proteiner fra obduktion hjernen væv Forberede ovn og inkubering glas dias der skal bruges til den efterfølgende fordampningsvarme med 5 mL af 100% myresyre. For at opnå en tilfredsstillende behandling, holde luftfugtigheden i inkubation glasfad på mætning niveau i hele dette trin og holde temperaturen ved 60 ° C. Væv objektglassene i inkubation glasfad samtidig undgå neddykning i myresyre og behandle for 6 min. Tage et optisk billede af prøverne ved hjælp af en filmscanner, gel scanner eller et digitalt mikroskop, etc. udføre dette trin ved stuetemperatur. Justering af den optiske billede af prøverne er nødvendig, når prøven mål er placeret inde i apparatet. Normalt, vil det ikke være muligt at genkende afsnittet væv nedenunder matrix lag.Bemærk: Den mest bekvemme måde at tage et optisk billede er at bruge en office-scanneren. Det er en god idé at gemme billedet i mappen billeddiagnostiske data opbevaring. For at korrelere de optiske billeder med prøverne, gøre guide mærker, der er synlige i den optisk billede og nedenunder matrix lag i kamera optik. Den nemmeste måde er at spot mindst tre korrektion væske mærker omkring prøven før du tager den optisk billede. Matrix ansøgning Forberedelse af matrix løsningen I et organisk opløsningsmiddel-tolerant microtube, forberede en 10 mg/mL SA løsning i 50% acetonitril (ACN) og 0,1% TFA. Grundigt opløses SA sammensatte af vortexing eller korte ultralydbehandling i 10 min. butik løsning ved stuetemperatur indtil brug.Bemærk: Der er tre forskellige muligheder for matrix sprøjtning: ved hjælp af en airbrush, en ultrasonic sprøjten eller en automatiske sprøjten. Sprøjtning matrixen med en airbrush Udføre handlingen med en konstant rumtemperatur (20 – 23 ° C) og fugtighed (40%-60%). Parametre til at justere for optimal sprøjtning omfatter størrelsen af dråben, mængden af tåge, vinkel og afstand mellem spray dyse og afsnittet væv laboratorium temperatur og luftfugtighed. Justere disse betingelser ved at kontrollere mikroskopi resultater.Bemærk: Som begrænsende faktorer omfatter krystal størrelse og homogenitet af matrix dækning og uønsket migration/udbredelse af analysander, mindre er bedre for drop størrelse. Ensartethed er også formålet med inspektion. Sprøjtning matrixen med en ultralyds sprøjte Fjern væv skal sprøjtes fra ekssikkatoren og placere den i salen. Sørg for, at væv ikke dækker vinduet sensor. Start forberedelse ved at trykke på Start knappen; normalt, er forberedelsestid omkring 90 min. Forberedelsen vil reguleres automatisk via overvågning af matrix lagtykkelse og væde. Efter forberedelsen er færdig, Fjern diaset og gemme det i ekssikkator til 15 min før du læser det i MALDI instrument. Ren sprøjte med 2-3 mL 100% MeOH indtil spray hovedet vises ren.Bemærk: En fin tåge af matrix dråber er tilladt at synke ind i vævet af en gravitationel ark. En gennemsnitlig Dråbestørrelse 20 μm genereres; alle dråbe diameter er mindre end 50 μm. Sprøjtning matrixen med en automatisk sprøjte Spray matrix løsning på væv overfladen med en automatisk sprøjten. Et konstant flow af opvarmet kappe gas (N2, sat til 10 psi og 75 ° C) vil blive leveret conjointly med matrix løsning spray. Bruge et opløsningsmiddel pumpesystem (sat til 10 psi og 0,15 mL/min.) til at levere matrix løsningen.Bemærk: Vigtigst arbejde under en sikkerhed fryser til at undgå enhver indånding af matrix aerosoler. Styre rumtemperatur og luftfugtighed til at reproducere homogen matrix krystallisering. 2. MALDI-IMS Udføre ultra-high-speed massespektrometri. Udføre høj overførselshastighed og høje rummæssige imaging eksperimenter med MALDI-IMS udstyret med en 10 kHz ND: YAG (355 nm) laser. For massespektrometri målinger, definere områderne væv ved hjælp af MALDI kontrol software og data analyse software. Erhverve spektre i en positiv lineær tilstand med en massiv vifte af m/z 2.000 – 20.000 og en rumlig opløsning på 20 og 100 µm. For at gøre kalibrering standard, opløse peptid kalibreringsstandardens og protein kalibreringsstandardens med et forhold på 1:4 med alpha-Cyano-4-hydroxy-cinnamic syre (CHCA) i TA30 løsning (ACN:0.1% TFA = 30:70) og derefter fortynde det 10 x. Placer 1 μL af kalibrering standard på dias på fire forskellige steder. Ved hjælp af molekylære histologi software (Se Tabel af materialer), overlay flere enkelt billeder at finde rumlige korrelationen mellem forskellige signaler, som forskellige Aβ peptider colocalizing i SPs og arteriel vægge. 3. databehandling For spektrale justering, justeres alle spektre en valgte m/z liste fra en tidligere publikation21. Importere MALDI-IMS datasæt til statistisk analyse software (Se Tabel af materialer) med baseline subtraktion. Spore regioner af interesse (ROIs) baseret på histologiske viden. Udføre en inputområdet analyse for de gennemsnitlige intensiteter, standardafvigelser, afsløring af diskriminerende m/z-markører (ROC analyse), hypotese test og opdagelsen af colocalized m/z-værdier. Oprette en segmentering kort. Udføre en uovervåget multivariat analyse til den geografiske segmentering af store datasæt og en komponent analyse for udvinding af underliggende tendenser. Vælg anatomiske ROIs baseret på histologiske karakteristika, såsom parenkym og subarachnoidale rum. Tildele strukturer som individuelle ROIs og sammenholde dem med de forarbejdede data, MS for at identificere de tilknyttede peptider, der tillod billedsegmentering i regionen.

Representative Results

Sporadiske AD patienter med CAA (n = 5; gennemsnitsalder = 83,2 y) og alderen emner med senil plaque gratis (SP O) og CAA (n = 5; gennemsnitsalder = 77,2 y) blev analyseret (tabel 1). CAA fænotyper af patienten #3 var mest fremtrædende i denne undersøgelse. Fordelingen af Aβ1-40 og Aβ1-42 indskud i hjernevæv fra patienten #3 blev visualiseret med MALDI-IMS (figur 1). Der var ingen signifikant signaler i nonpathological kontrol hjerner (patienter #9 og #10), som vist i figur 1. Her visualiseres MALDI-IMS klart at Aβ1-42 fortrinsvis blev deponeret som SPs i den cerebrale parenkym. Kortere Aβs, som Aβ1-36 1-41, blev derimod fortrinsvis deponeret på leptomeningeal vaskulære områder (figur 1). Fordelinger af Aβ40 og Aβ42 blev yderligere bekræftet med IHC ved hjælp af tilstødende frosne dele af væv. Anti-Aβ40 antistof mærket CAA (pile i figur 2B), hvilket står i klar kontrast til fordeling af Aβ42 i den cerebrale parenkym som SPs. For Aβ1-41, vi er de første til at opdage dette fragment i menneskets hjerne, og vi har genereret specifikke antistoffer, der kan skelne Aβ41 fra Aβ40 andAβ4221. Den rumlige opløsning MALDI-IMS er generelt den vigtigste faktor til at blive endnu bedre. I figur 1 og figur 2 viser MALDI-IMS med 100 µm pitch opløsning og opnå en samlet distribution profil for et relativt stort område21. Det er vanskeligt at definere amyloid aflejring præcis på subarachnoidale rum, herunder vaskulære struktur. At skildre fine væv strukturer over subaraknoid fartøjer og overfladen af cortex, høj opløsning MALDI imaging (40 µm: figur 3; 20 µm: fig. 4 og figur 5) blev udført. Som et resultat, påvist MALDI-IMS klart, at kortere Aβs, som Aβ1-36 1-41, fordeles i væggene i arterierne, som er sammenlignelige med IHC. MALDI-IMS demonstreret de detaljerede fordelinger af både Aβx-40 og Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 og 11pE) i annonce ledsaget med moderat CAA hjerne. For eksempel, mens Aβx-40 arter viste en lignende distribution profil til Aβ1-40, Aβx-42 arter viste en anderledes fordeling mønster med Aβ1-4221. Af den nuværende protokol tildeles enkelt ion billeder af de enkelte Aβ peptider observeret med MALDI-IMS Aβ arter. Derimod erhvervede billede data kan undersøges ved hjælp af ukontrollerede multivariat statistik for at få billedsegmentering af anatomiske områder af interesse for den yderligere analyse af udefineret proteiner. Figur 5 viser en segmentering kort fremstillet med et gennemskærende k-betyder analyse anvendes til samme afsnit fra patienten #321. Denne clustering metode identificeret med held plaque-lignende strukturer i parenkym (blå i figur 5 c) og vaskulære strukturer i subarachnoidale rum (grøn i figur 5 c). Det er interessant at finde et lille cirkulære område i parenkym, der er registreret lige omkring en lille arteriole i parenkym samt i subarachnoidale rum (lilla i figur 5 c). Dette er bekræftet af enkelt ion billeder af disse individuelle Aβ peptider i figur 5 d-5F. Figur 1: MALDI-IMS af en frossen annonce/CAA hjerne afdeling. Forskellige C-terminale afkortet Aβ peptider i annonce ledsagende svær CAA (patienten #3) er visualiseret i venstre panel og kontrol (patienten #9 til højre og patienten #10 til venstre i alle billeder) i det højre panel. Aβ1-36 til Aβ1-41 er fortrinsvis deponeret i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er deponeret i de cerebrale parenkym som senile plaques i tilfælde af at #3, mens der var ingen signal kontrol patienter ‘ hjerne (tilfælde #9 og #10). Resolution = 100 μm. Skalalinjen = 5 mm. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Kakuda et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: MALDI-IMS af frosne annonce/CAA hjerne dele og tilstødende dele af occipital cortex fra AD hjerner. (A – C) frosne annonce/CAA hjernen sektioner og (D og E) tilstødende dele af occipital cortex fra AD hjerner var immun-farvede og fokuseret på arteriole og cerebral parenkym, ved hjælp af antistoffer mod Aβ40 (D: BA27) eller Aβ42 (E: anti-Aβ42 polyklonale). Begge analyser viste, at Aβ40 fortrinsvis er deponeret i leptomeningeal blodkar (pile i panelet D) og arterioler i subarachnoidale rum og den cerebrale parenkym danner CAA. Aβ42 er derimod primært deponeret i SPs. For IMS, opløsning = 100 μm. Skalalinjen = 5 mm (A, Bog C) = 5 mm, 500 (D og E). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Kakuda et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: MALD-IMS af frosne annonce/CAA hjerne sektioner (patienten #3) med en opløsning på 40 µm. Forskellige C-terminal og N-terminale afkortet og modificeret Aβ peptider i annonce ledsagende svær CAA (patienten #3). Aβ1-36 til Aβ1-41 er fortrinsvis deponeret i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er deponeret i de cerebrale parenkym som senile plaques. Skalere barer = 1 mm (A-B), 2 mm (øverst til venstre). Resolution = 40 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: MALDI-IMS af frosne annonce/CAA hjerne sektioner (patienten #3) med en opløsning på 20 µm. Dette panel viser forskellige C-terminal og N-terminale afkortet og modificeret Aβ peptider i annonce ledsagende svær CAA (patienten #3). Aβ1-36 til Aβ1-41 er fortrinsvis deponeret i leptomeningeal blodkar, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 er deponeret i de cerebrale parenkym som senile plaques. Skalere barer = 200 μm (a, b, c), 1 mm (øverst til venstre). Resolution = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5: segmentering kort, fremstillet ved MALDI-IMS af en frossen AD hjernen sektion, afslører formodede senil plaque, store subaraknoid fartøj strukturer og små parenkymalt arterioler. (A) segmentering kort fremstillet en flerdimensional billedanalyse af MALDI-IMS data. (B) Bisecting k-betyder baseret klyngedannelse analyse identificeret plaque-lignende og skib-lignende strukturer i occipital cortex. Klynger og ofringer og deres forbindelser vises som noder (e.g.,1-0-0). (C) forskellige Aβ peptid lokalisering mønstre der ligner plaques (blå), subaraknoid fartøjer (grøn) og arteriole (rød) strukturer. Bemærk, at et par røde klynger er også distribueres i subarachnoidale rum. Dette er bekræftet af enkelt ion billeder af disse individuelle Aβ peptider ved en 20 µm opløsning: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41, og (F) Aβ 1-42. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Sag Køn Alder ved død Braak SP CAA 1 M 83 C 0,5 2 M 88 C 1 3 M 84 C 2 4 M 78 C 1 5 M 83 C 1 6 M 84 O 0 7 M 78 O 0 8 M 70 O 0 9 M 73 O 0 10 M 81 O 0 Tabel 1: kliniske og patologiske data af annonce med CAA sager og alderen SP O emner. Menneskelige kortikale prøver for IMS og IHC blev indhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute i gerontologi. Hver hjerne enheden blev indfanget occipital cortex af fem AD patienter og fem alder-matchede kontrol. Omfanget af amyloid aflejring som vist ved en Aβ monoklonalt antistof blev defineret af Braak SP (amyloid) faser. På tidspunkt O er der næsten ingen senile plaques i hele isocortex. I fase C, er stort set alle isocortical områder berørt. Annonce hjerner er uforanderlig på fase C. Denne tabel er blevet ændret med tilladelse fra Kakuda et al.21.

Discussion

Her vi vist en detaljeret protokol og resultaterne af visualisering af Aβ og dens isoformer fra flere autopsied hjerner med annonce og CAA med MALDI-IMS. Profilen deposition af Aβs blev drastisk ændret fra Aβ1-42 til sin N – og C-terminale variationer. Aβ1-41 blev først identificeret og visualiseret i menneskers hjerner med den nuværende protokol og blev yderligere valideret med IHC²¹. I betragtning af at morfologi af deponerede Aβ af IMS med en høj opløsning analyse (20 μm) skal være i god aftale med IHC, bidrage IMS og IHC ligeledes til skelne Aβ indskud af deres placering og protein indhold, samt af deres morfologi. Som hele eksperimentet beskrevet her blev gennemført i occipital cortex, vil studerer lokalisering af forskellige arter, beta-amyloid på tværs af alle områder af hjernen være generaliseret med fremtidige eksperimenter ved hjælp af den aktuelle protokol.

Kritiske trin i protokollen er væv forberedelse skridt til at opnå en effektiv ionisering af aggregerede proteiner i human hjerne væv. En matrix lag er forpligtet til at absorbere laser energien og fremkalde desorption og ionisering af analysander. I denne proces, er en hele væv afsnit administrationsprocedurerne belagt med små krystaller. Homogen cocrystallization af analysand med matrix er afgørende for høj følsomhed og artefakt-fri imaging. Hver af de tre spray metoder har sine egne fordele. Manuel spray belægning er en af de hyppigst anvendte metoder. En airbrush er bekvemt; Det kræver dog dygtige operation. Nøjagtige og reproducerbare eksperimentel teknik er væsentlige, anbefales ved hjælp af en ultralyds sprøjten og/eller en automatisk sprøjte som beskrevet i de nuværende protokoller. Med hensyn til en ultralyd sprøjten, vil det ikke være påvirket af fugtighed og temperatur i rummet fordi det sprøjtes ind i et kammer. I mellemtiden, med en automatisk sprøjter, relativt konserveret rumlige opløsning med god reproducerbarhed er opnået. Generelt, den rumlige opløsning fremstillet med tre metoder stigning i størrelsesordenen 1) airbrush, 2) automatisk anordning og 3) ultralyd sprøjten.

Vigtigst, blev denne protokol oprindeligt oprettet for at opdage og visualisere Aβs i autopsied menneskehjerne prøver. Visualisering af Aβs med MALDI-IMS for APP23 mus, som er oprettet som en dyremodel af annonce baseret på svensk-type mutationen af menneskelige APP, har været rapporteret tidligere af andre med en eksisterende metode^18,19. Den tidligere protokol anvendes til APP23 var imidlertid ikke tilstrækkelige til at visualisere Aβ i sin laterale opløsning og følsomhed. Tidligere værker drøftet, at høje Aβ koncentrationer uden det væv er klart artefakter i APP23 imaging med deres protokol^18,19. Det betyder, at den såkaldte ‘sløre’ mellem virkelige SPs og IMS billeder på grund af matrix ekstraktionstrinet var uundgåeligt med MALDI-type billeddannelse. Men i den nuværende protokol, sløringen forsvandt og hvert spektrum repræsenteret hver enkelt SP i hjernen parenkym.

Som vist her, vi kan spore Aβ1-41 for første gang i annonce og CAA hjerner med MALDI-IMS samt med IHC, med et specifikt antistof i vores egen generation²¹. Ifølge modellens Aβ forarbejdning stammer Aβ1-38 fra Aβ1-45 via Aβ1-42, mens Aβ1-41 stammer fra Aβ1-45 af γ-secretase trinvis kavalergang^{27,28,29,30,31} . Det betyder, at den nuværende protokol understøtter denne model. Hvad angår begrænsningerne af denne teknik, skal vi overveje heterogenitet af prøver fra menneskelige obduktion hjernen. Den mest afgørende skridt i en vis forstand, er at vurdere kvalificeret obduktion hjernevæv med etiske bevis. Med den nuværende protokol om disse kvalificerede obduktion hjernen væv, kan MALDI-IMS individuelt spore hele fordelingen af de komplekse molekyler har flere ændringer samt ukendte faktorer regulering patogenesen af Annoncen, der endnu skal defineret. Desuden, i forståelsen af den overordnede patogenesen af forskellige neuropatologiske i alderen menneskelige hjerner, det skal være muligt at vedtage MALDI-IMS som en standard tilgang, i kombination med kliniske, genetiske og patologiske observationer i neurologiske sygdomme .

En anden kritisk trin MALDI-IMS er data mining proces fra de fremkomne data sæt, som altid er tidskrævende. Manuelle datamining af hver peak distribution kræver, at brugerne til at klikke gennem hvert billede og søger distributioner, som kan korrelere til morfologi for analyseret stikprøven. Automatisk rumlig opdeling kan bruges som det første trin i data mining, giver et overblik over datasættet og giver mulighed for hurtig påvisning af fremtrædende funktioner. I denne tilgang, lighederne mellem spektre i et givet område bestemmes statistisk og lignende spectra er grupperet i en klynge. Alle pixel farvekodes efter deres cluster tildeling (figur 5). I den nuværende annonce/CAA undersøgelse er området af interesse plads af Aβ depositioner i parenkymalt plak og de subaraknoidal og parenkymalt vaskulære strukturer. De to særprægede toppe, som blev yderligere bekræftet med IHC blev m/z-værdier fra Aβ1-40 og Aβ1-42²¹. Således, det er let at finde colocalized m/z med Aβ1-40 og Aβ1-42, som var allerede kommenteret til N – og C-terminale afkortet Aβ samt ukendt peptider, til yderligere analyse.

Weller og kolleger har rapporteret, at Aβ ophobes i fartøj vægge, mere omkring arterier end omkring vener²¹. Derudover er det blevet foreslået, at den interstitielle væske (ISF) omfatter Aβs udskilles fra den cerebrale parenkym til den lymfeknude via en perivascular dræning vej^{22,23,24,25 ,26}. Den nuværende protokol til at generere en segmentering kort baseret på et MALDI-IMS datasæt på 20 µm beslutning støtter den mulige eksistens af perivascular dræning stier i hjernen (figur 5), som bidrager betydeligt til CAA i AD^{21 , 32}. Desuden, vi kan opleve markør proteiner colocalized med plaque og subaraknoid Vaskulaturen ved at beregne korrelationen mellem hver m/z-værdier. For at forstå den samlede patogenesen af forskellige neuropatologiske i alderen menneskelige hjerner, skal det være muligt at vedtage MALDI-IMS som en kraftfuld tilgang i kombination med etablerede IHC data af kliniske, genetiske og patologiske observationer i neurologiske sygdomme.

Materials

Cryostat	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide	Bruker Daltonics	#237001
Blade (disposable)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	#117394
O.C.T. Compound	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	FSC 22 Blue
Scanner	EPSON	GT-980
Air-Brush	GSI Creos	PS274
Compressor	MRHOBBY	Mr.Linear compressor L5
Ultrasonic sprayer	Bruker Daltonics	ImagePrep
Automatic sprayer	HTX Technologies	TM Sprayer
Confocal-laser-scanning-microscope	Carl Zeiss Inc.	LSM 700
Ultra high speed MALDI instrument	Bruker Daltonics	rapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI control software	Bruker Daltonics	FlexControl 3.8
Data analysis software	Bruker Daltonics	FlexImaging 5.0
Molecular histology software	SCiLS, Bremen, Germany	SciLS Lab 2016a
Statistical software	SCiLS, Bremen, Germany	SciLS Lab 2016a
Sinapinic acid (SA)	Nacalai tesque	30494-91
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA)	Wako	037-19261
Calibration standard	Bruker Daltonics
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin and biotinylated HRP complex.	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA	Vectastain Elite ABC kit
3,3-diaminobenzidine (DAB)	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA	Vectastain Elite ABC kit