Molekylær bildebehandling med matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-basert bildebehandling massespektrometri (MALDI-IMS) tillater samtidig tilordning av flere analytter i biologiske prøver. Her presenterer vi en protokoll for oppdagelse og visualisering av amyloid β protein på hjernen vev av Alzheimers sykdom og cerebral amyloid angiopathy prøver ved hjelp av MALDI-IMS.
Neuropathology av Alzheimers sykdom (AD) er preget av Oppsamling og aggregering av amyloid β (Aβ) peptider i ekstracellulære plaketter av hjernen. Aβ-peptider som består av 40 aminosyrer, genereres fra amyloid forløper proteiner (APP) av β – og γ-secretases. Aβ er avsatt ikke bare i cerebral parenchyma, men også i leptomeningeal og cerebral fartøy vegger, kjent som hjerne amyloid angiopathy (CAA). Mens en rekke Aβ peptider ble identifisert, detaljert produksjon og distribusjon av individuelle Aβ peptider i patologisk vev annonse og CAA har ikke fullt adressert. Her utvikle vi protokollen matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-basert bildebehandling massespektrometri (MALDI-IMS) på menneskelig obduksjon hjernen vev å få omfattende protein kartlegging. For dette formålet, ble menneske kortikale prøver innhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute av Gerontology. Frosne cryosections kuttes og overført til indium-tin-oxide (ITO)-belagt glass lysbilder. Spectra er ervervet ved hjelp av MALDI systemet med en romlig oppløsning opptil 20 µm. Sinapinic syre (SA) avsettes jevnt på lysbildet med enten automatisk eller en manuell sprøyta. Med gjeldende tekniske fordelene ved MALDI-IMS, kan en typisk sett forskjellige Aβ arter innen samme delene av menneskelig autopsied hjernen fås uten spesifikk sonder. Videre med høy oppløsning (20 µm) avbildning av en annonse hjernen og alvorlig CAA eksempel viser tydelig at Aβ1-36 til Aβ1-41 var satt inn leptomeningeal fartøy, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 avsatt på cerebral parenchyma som senil plakk (SP). Det er mulig å adoptere MALDI-IMS som en tilnærming i kombinasjon med klinisk, genetisk og patologisk observasjoner forstå patologi annonse, CAA, og andre nevrologiske sykdommer basert på gjeldende strategi.
For å gjøre diagnosen og forstå patogenesen av nevrodegenerative lidelser, er presise molekylære identifikasjon av patologisk innskudd viktig1. I Annonsen, Aβ er produsert for å gjøre SPs i cerebral parenchyma og deponert i fartøy lenge før sykdommen utbruddet2,3,4,5,6. Aβ1-42 er den dominerende peptid på SP AD hjerner, andre Aβ varianter, som N-terminal eller C-terminalen avkuttet eller endret Aβs, identifiseres også i berørte AD hjerner7,8,9, 10. Et fullstendig bilde av bredt spekter av Aβ arter i menneskelige hjerne, spesielt med Annonsen og cerebral amyloid angiopathy (CAA)11, vil hjelpe forskere til å forstå Aβ produksjon, metabolisme og deponering.
Som den klassiske tilnærmingen til neuropathology, har immunohistochemistry (IHC) vært den mest avgjørende metoden for å bestemme plasseringen av Aβs i hjernen vev12,13,14,15. IHC kan generelt skille molekyler når flere epitopes eksistere samtidig. En voksende masse massespektrometri-baserte proteomic analyse er derimot en verdifull tilnærming spesielt for å analysere en rekke Aβ arter i hjernen vev, som kan være med antistoffer16,17. Konvensjonelle masse massespektrometri-basert analyse av hjernen lysates og immun-igangsatte prøver svikter å merker mindre Aβ peptider og mister distribusjonsinformasjon av Aβ i hjernevevet.
I tidligere arbeider, har visualisere Aβ innskudd i musen hjerner vært vellykket bruker en transgene dyr modell av annonse, for eksempel APP23. Denne prosessen trenger imidlertid fortsatt tekniske fremskritt sammenligne IMS og IHC med hensyn til oppløsning og følsomhet18,19,20. AD neuropathology bør studeres på menneskelige hjerne, og vi brukte MALDI-IMS teknologi på menneskelig obduksjon hjernen vev for å få omfattende protein kartlegging21. For dette formålet utviklet vi en protokoll for en avansert massespektrometri som har fordeler i hurtighet, følsomhet og reproduserbarhet.
Her vi viste en detaljert protokoll og resultater for visualisering av Aβ og dens isoformene fra flere autopsied hjernen med Annonsen og Luftfartstilsynets med MALDI-IMS. Deponering profilen Aβs ble drastisk endret fra Aβ1-42 til sine N – og C-terminalen varianter. Aβ1-41 ble først identifisert visualisert i menneskelige hjerne med gjeldende protokollen og ble ytterligere bekreftet med IHC21. Tatt i betraktning at morfologi av avsatt Aβ av IMS med en høy oppløsning analyse (20 μm) må være i god avtale med IHC, bidrar IMS og IHC like til å skille Aβ innskudd av deres plassering og protein innhold samt deres morfologi. Som hele eksperimentet beskrevet her ble gjennomført i occipital cortex, vil studere lokaliseringen av ulike beta-amyloid arter i alle regioner, hjernen være generalisert med senere eksperimenter ved hjelp av gjeldende protokollen.
Avgjørende skritt i protokollen er vev forberedelse skritt å få en effektiv ionisering aggregert proteiner i hjernen vev. En matrise laget er nødvendig å absorbere på laseren energi og indusere desorpsjon og ioniseringen av analytter. I denne prosessen er en hele vev delen homogent belagt med små krystaller. Homogen cocrystallization av analytt med matrix er avgjørende for høy følsomhet og gjenstand-fri bildebehandling. Hver av de tre spray metodene har sine egne fordeler. Manuell spray belegg er en av de mest brukte metodene. En airbrush er praktisk; det krever imidlertid dyktigste drift. Presis og reproduserbar eksperimentelle teknikk er viktig, anbefales bruker en ultralyd sprøyta og/eller en automatisk sprøyta som beskrevet i gjeldende protokollene. Med hensyn til en ultralyd sprøyta, vil det ikke bli påvirket av luftfuktighet og temperatur i rommet fordi det er sprayet inn et kammer. I mellomtiden med en automatisk sprøyta oppnås relativt bevarte romlig oppløsning med god reproduserbarhet. Vanligvis romlig oppløsning med tre metoder økningen i 1) airbrush, 2) automatisk enhet og 3) ultralyd sprøyta.
Høyst betydelig, ble denne protokollen opprinnelig generert for å oppdage og visualisere Aβs i autopsied hjernen prøver. Visualisering av Aβs med MALDI-IMS for APP23 mus, som genereres som en dyremodell annonse basert på svensk-type mutasjon av menneskelig APP, har blitt rapportert tidligere av andre med en eksisterende metode18,19. Men var tidligere protokollen på APP23 ikke tilstrekkelig til å visualisere Aβ i laterale oppløsning og følsomhet. Tidligere arbeider diskutert at høye Aβ konsentrasjoner utenfor vev grensen er tydelig gjenstander i APP23 imaging med deres protokollen18,19. Det betyr at den såkalte “blur” mellom ekte SPs og IMS bilder på grunn av matrix utvinning trinnet var uunngåelig med MALDI-type imaging. Men i gjeldende protokollen, uskarphet forsvant og hver spektrum representert hver enkelt SP i hjernen parenchyma.
Som vist her, vi kan spore Aβ1-41 for første gang i AD og CAA hjernen med MALDI-IMS og med IHC, med et spesifikt antistoff av vår egen generasjon21. Ifølge Aβ behandling modellen stammer Aβ1-38 fra Aβ1-45 via Aβ1-42, mens Aβ1-41 stammer fra Aβ1-45 ved γ-secretase gradvis cleavage27,28,29,30,31 . Dette betyr at gjeldende protokollen støtter denne modellen. Som for begrensninger av denne teknikken, må vi vurdere heterogenitet prøvene fra menneskelige obduksjon hjerne. Det viktigste trinnet i en forstand, er å vurdere kvalifiserte obduksjon hjernevev etiske bevis. Med gjeldende protokollen på de kvalifiserte obduksjon hjernen vev, kan MALDI-IMS individuelt spore hele fordelingen av komplekse molekyler har flere endringer, samt ukjent factor(s) regulerer patogenesen av Annonsen, som enda blir definert. Videre forstå samlede patogenesen av ulike neuropathology i alderen menneskelige hjerne, må det være mulig å adoptere MALDI-IMS som en tilnærming, i kombinasjon med klinisk, genetisk og patologisk observasjoner i nevrologiske sykdommer .
En annen viktig trinn i MALDI-IMS er data mining prosessen fra innhentet datasettet, som alltid tidkrevende. Manuell datamining hver topp distribusjon krever brukerne klikker gjennom hvert bilde og se etter distribusjoner som kan relateres til morfologi av analysert prøven. Automatisk romlige segmentering kan brukes som første trinn i data mining, gir en oversikt over datasettet og tillater rask påvisning av fremtredende. I denne likheter mellom spektra av et område er statistisk bestemmes og lignende spectra er gruppert i en klynge. Alle bildepunkter er fargekodet etter klynge oppdrag (figur 5). AD/CAA studien er området av interesse for Aβ depositions i parenchymal plakk og subarachnoid og parenchymal vaskulære strukturer. De to karakteristiske toppene som ble ytterligere bekreftet med IHC var m/z-verdier fra Aβ1-40 og Aβ1-4221. Dermed er det lett å finne colocalized m/z med Aβ1-40 og Aβ1-42 som var allerede kommentert til N – og C-terminalen avkortet Aβ, samt ukjent peptider, for videre analyse.
Weller og kolleger har rapportert at Aβ akkumuleres i fartøyet vegger, mer rundt arterier enn rundt vener21. Dessuten, det har blitt foreslått at den interstitielle væsken (ISF) inkluderer Aβs utskilt fra cerebral parenchyma til den lymfeknute via en perivascular drenering veien22,23,24,25 ,26. Gjeldende protokollen for å generere en segmentering kart basert på en MALDI-IMS datasett 20 µm oppløsning støtter den mulige eksistensen av perivascular drenering stier av hjernen (figur 5), som bidrar betydelig til CAA i AD21 , 32. Videre kan vi oppdage markør proteiner colocalized med plakk og subarachnoid blodkar ved å beregne korrelasjon av hver m/z-verdier. Forstå generelle patogenesen av ulike neuropathology i alderen menneskelige hjerne, må det være mulig å vedta MALDI-IMS som en effektiv tilnærming i kombinasjon med etablerte IHC data av klinisk, genetisk og patologisk observasjoner i nevrologiske sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (hjernen Protein aldring og demens kontroll 26117004, M.I. og T.M.). Denne forskningen ble delvis støttet av strategisk forskningsprogrammet for hjernen vitenskap fra Japan byrået for medisinsk forskning og utvikling (AMED). Alle eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene som ANKOMME.
Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
Scanner | EPSON | GT-980 | |
Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |