मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तीन आयामी दृश्य के लिए हल्की चादर माइक्रोस्कोपी
Summary
यहां, हम एक तीन आयामी (3 डी) कोलेजन मैट्रिक्स प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर में एम्बेडेड प्रतिरक्षा कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । यह प्रोटोकॉल भी कैसे 3 डी में सेल माइग्रेशन ट्रैक करने के लिए सविस्तार । इस प्रोटोकॉल 3 डी मैट्रिक्स में निलंबन कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
Abstract
vivo में, सक्रियण, प्रसार, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह में सभी हो एक तीन आयामी (3 डी) वातावरण, उदाहरण के लिए लिम्फ नोड्स या ऊतकों में. अप टू डेट, इन विट्रो सिस्टम में अधिकांश दो आयामी (2d) सतहों, जैसे सेल-कल्चर प्लेट्स या coverslips पर निर्भर करते हैं । बेहतर इन विट्रो मेंशारीरिक शर्तों की नकल करने के लिए, हम एक साधारण 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स का उपयोग । कोलेजन extracellular मैट्रिक्स (ECM) के प्रमुख घटकों में से एक है और व्यापक रूप से 3 डी मैट्रिक्स का गठन किया गया है । 3 डी इमेजिंग के लिए, हाल ही में विकसित प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी (भी एकल विमान दीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में संदर्भित) उच्च अधिग्रहण की गति, बड़ी पैठ गहराई, कम ब्लीचिंग, और photocytotoxicity के साथ चित्रित किया है । इसके अलावा, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी दीर्घकालिक माप के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है । यहां हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे स्थापित करने के लिए और मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संभालने के लिए, उदाहरण के लिए प्राथमिक मानव साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) और 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में प्राकृतिक हत्यारा (NK) प्रकाश के साथ उपयोग के लिए कक्ष-शीट माइक्रोस्कोपी लाइव सेल के लिए इमेजिंग और निर्धारित नमूनों । छवि प्राप्ति और सेल माइग्रेशन के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत कर रहे हैं । नमूना तैयारी और डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण चरणों और कारकों को हाइलाइट करने के लिए एक विशेष ध्यान दिया जाता है । इस प्रोटोकॉल एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में निलंबन कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए नियोजित किया जा सकता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है ।
Introduction
कोशिकाओं के प्रवास के बारे में सबसे अधिक जानकारी 2d प्रयोग1,2,3से आता है, जो आम तौर पर एक गिलास या एक संस्कृति के प्लास्टिक की सतह/ हालांकि, एक शारीरिक परिदृश्य की आवश्यकता है, ज्यादातर मामलों में, एक 3d microenvironment, जिसमें extracellular मैट्रिक्स (ECM) एक निर्णायक भूमिका निभाता है । ECM न केवल उचित सेल आकृति विज्ञान बनाए रखने के लिए आवश्यक 3d संरचना प्रदान करता है लेकिन यह भी कई कोशिकाओं के एक इष्टतम कार्य के लिए अस्तित्व के संकेत या दिशात्मक cues प्रदान करता है4,5 . इसलिए, एक 3 डी वातावरण बेहतर एक बेहतर शारीरिक संदर्भ को प्रतिबिंबित वातावरण में सेलुलर कार्यों और व्यवहार की पहचान करने के लिए आवश्यक है ।
मानव शरीर में, ज्यादातर कोशिकाओं विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एक 3 डी परिदृश्य के तहत अपने कार्यों डालती है । उदाहरण के लिए, सक्रिय टी कोशिकाओं गश्ती ऊतकों लक्ष्य कोशिकाओं के लिए खोज, भोली टी कोशिकाओं उनके cognate प्रतिजन के लिए खोज में लिम्फ नोड्स के माध्यम से माइग्रेट-कोशिकाओं के दौरान जो माइग्रेशन मोड और मशीनरी संगत extracellular के लिए अनुकूलित कर रहे हैं पेश पर्यावरण3,6,7। 3 डी कोलेजन जेल व्यापक रूप से एक अच्छी तरह से स्थापित और अच्छी तरह से 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली8,9,10विशेषता के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हमारे पिछले काम से पता चलता है कि प्राथमिक मानव लिम्फोसाइटों उच्च मोबाइल और लगभग ४.८ µm/मिनट की एक औसत गति से एक ०.२५% कोलेजन में विस्थापित-11मैट्रिक्स आधारित है । cytoskeleton की पुनर्व्यवस्था कक्ष माइग्रेशन12में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सबूत जमा करने से पता चलता है कि लिम्फोसाइटों केवल माइग्रेशन का केवल एक ही मोड लागू न करें अभी तक स्थान, microenvironment, साइटोकिंस, chemotactic ग्रेडिएंट्स, और extracellular संकेतों के आधार पर कुछ माइग्रेशन व्यवहार के बीच स्विच कर सकता है जो ट्यून करता है विभिंन तरीकों से प्रवासी व्यवहार 3।
मज़बूती से प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों और व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, उदाहरण के लिए, प्रवास, घुसपैठ गठन या vesicular परिवहन, यह काफी लाभ की है एक तेज और विश्वसनीय तरीके से अपेक्षाकृत बड़े 3 डी मात्रा में छवियों को प्राप्त करने में सक्षम हो । 3 डी इमेजिंग के लिए, हाल ही में विकसित प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी (भी एकल विमान दीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में संदर्भित) एक संतोषजनक समाधान13,14प्रदान करता है । इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान, एक पतली स्थिर प्रकाश चादर नमूना रोशन करने के लिए उत्पंन होता है । इस तरह, फोकस विमान पर, एक बड़े क्षेत्र से एक साथ प्रबुद्ध किया जा सकता है बंद विमान कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना । यह सुविधा अत्यधिक कम ब्लीचिंग और photocytotoxicity के साथ उच्च प्राप्ति गति को सक्षम बनाती है । इस पत्र में, हम वर्णन कैसे प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं को कल्पना और कैसे एक 3 डी परिदृश्य में प्रवास का विश्लेषण करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में अधिकांश परख एक 2d सतह पर किए जाते हैं, उदाहरण के लिए सेल में संस्कृति प्लेटें, पेट्री-व्यंजन या coverslips पर, जबकि vivo कोशिकाओं में , विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, अनुभव ज्यादातर एक 3d microenvironmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम क्लिनिकल Hemostaseology और दाता रक्त प्रदान करने के लिए चढ़ाए दवा के लिए संस्थान को धन्यवाद; कारमेन Hässig और उत्कृष्ट तकनीकी मदद के लिए को्् Hoxha । हम Rettig (Saarland विश्वविद्यालय) के संशोधित pMAX वेक्टर, रोलाण्ड Wedlich-Söldner (Muenster विश्वविद्यालय) के लिए मूल LifeAct-रूबी के निर्माण के लिए धंयवाद, और क्रिश्चियन कबाड़र (Saarland विश्वविद्यालय) LifeAct-mEGFP निर्माण पैदा करने के लिए । इस परियोजना को Sonderforschungsbereich १०२७ (परियोजना A2 से B.Q.) और ८९४ (परियोजना A1 से M.H.) द्वारा वित्तपोषित किया गया था. प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप DFG द्वारा वित्त पोषित किया गया था (GZ: 256/4 19-1 FUGG) ।
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
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