Свет лист микроскопии для трехмерной визуализации иммунных клеток человека
Summary
Здесь мы представляем протокол визуализировать клетки иммунной системы, внедренные в матрицу трехмерного (3D) коллагена, с помощью микроскопии свет лист. Этот протокол также рассматриваются как отслеживать миграции клеток в 3D. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в матрице 3D.
Abstract
В естественных условиях, активации, распространением и функции всех иммунокомпетентные клетки происходят в трехмерных (3D) среде, например в лимфатических узлах или тканей. До даты большинство систем в vitro полагаются на двухмерный (2D) поверхности, такие как культура клетки пластин или coverslips. Чтобы оптимально мимических физиологических условиях в пробиркемы используем простой 3D коллагеновой матрицы. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и широко используется в качестве 3D матрицы. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) отличен с высокой скоростью, большие глубины, низкий отбеливания и photocytotoxicity. Кроме того свет лист микроскопии является особенно выгодным для долгосрочных измерений. Здесь мы описываем оптимизированный протокол как создать и обработать человека иммунные клетки, например первичного человека цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и природные убийца (НК) клетки в 3D коллагеновой матрицы для использования с свет лист микроскопии для живых клеток и фиксированных выборок. Процедура приобретения изображений и анализа миграции клеток представлены. Особое внимание уделяется выделить важные шаги и факторы для пробоподготовки и анализа данных. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в 3D коллагеновой матрицы и не ограничивается иммунных клеток.
Introduction
Большинство знаний о миграции клеток происходит от 2D экспериментов1,2,3, которая обычно проводится в стеклянные или пластмассовые поверхности культуры/изображений блюдо. Однако, в большинстве случаев, физиологические сценарий требует 3D микроокружения, в котором внеклеточного матрикса (ECM) играет решающую роль. ECM не только обеспечивает эфирное 3D структуры для поддержания надлежащего клеток морфологии, но также предлагает выживания сигналов или направленного подсказки для оптимального функционирования многих клеток4,5 . Таким образом 3D окружающей среды требуется для лучшего определения клеточных функций и поведения в среде, лучше отражающие физиологических контекст.
В человеческом теле большинство клеток особенно иммунных клеток, оказывают свои функции согласно сценарию 3D. К примеру активированные Т-клетки сторожевые тканей, поиск для клеток-мишеней, наивно T-клетки мигрируют через лимфатические узлы в поисках их родственных антиген представляющих клеток, во время которых режим миграции и машины адаптированы к соответствующим внеклеточного окружающей среды3,6,7. Геля 3D коллаген широко использовался как устоявшихся и хорошо изученных 3D клеточной культуры системы8,9,10. Наши предыдущие работы показывает, что основной лимфоцитах человека мобильны и мигрируют со средней скоростью около 4,8 мкм/мин в 0,25% коллагена основе матрицы11. Перестановка цитоскелета играет ключевую роль в миграции клеток12. Накопление доказательств показывает, что лимфоциты не применяется только один режим миграции еще можно переключаться между определенное поведение миграции в зависимости от местоположения, микроокружение, цитокины, эозинофилов градиенты, и внеклеточных сигналов какой мотив мигрирующие поведение в 3различными способами.
Для надежного анализа иммунных клеток функции и поведение, например, миграция, формирования протрузии или везикулярный транспорт, это большое преимущество, чтобы иметь возможность получить изображения в относительно больших объемах 3D быстрым и надежным способом. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) предлагает удовлетворительного решения13,14. Во время визуализации приобретения, тонколистовой статический свет генерируется для освещения образца. Таким образом, на плоскости фокуса большой площади может быть освещен одновременно не затрагивая-плоскости клетки. Эта функция позволяет высокой скоростью с резко сниженным отбеливания и photocytotoxicity. В этой статье мы описываем, как визуализировать первичного человека иммунные клетки, с помощью микроскопии свет листа и как для анализа миграции в сценарии 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство анализов в vitro осуществляется на 2D поверхности, например в культуре клеток тарелки, чашки Петри или на coverslips, тогда как в естественных условиях клетки, особенно иммунные клетки, опыт работы главным образом 3D микроокружения. Новые свидетельства показывает, что мигр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим институт клинической Hemostaseology и трансфузионной медицины для предоставления донорской крови; Кармен Hässig и кора Ходжа за отличную техническую помощь. Мы благодарим Jens Реттиг (Университет Саарленд) для модифицированных pMAX вектора, Roland Ведлих-Söldner (Университет Мюнстер) для оригинальной конструкции рубиново-LifeAct и Кристиан Юнкер (Университет Саарленд) для генерации LifeAct-mEGFP конструкции. Этот проект финансировался 1027 Sonderforschungsbereich (проект A2 до B.Q.) и 894 (проект A1 м.г.). Микроскоп свет лист был финансируемых DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
