Ljus-ark mikroskopi för tredimensionell visualisering av mänskliga immunceller
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera immunceller inbäddad i en tredimensionell (3D) kollagen matris med hjälp av ljus-ark mikroskopi. Detta protokoll utarbetar också hur spåra cellmigration i 3D. Detta protokoll kan användas för andra typer av fjädring celler i matrisen 3D.
Abstract
In vivo, aktivering, spridning och funktion av immunceller som alla förekommer i en tredimensionell (3D)-miljö, exempelvis i lymfkörtlar eller vävnader. Upp till datum, de flesta i vitro system förlitar sig på tvådimensionell (2D) ytor, såsom cellkultur plattor eller coverslips. Att optimalt härma fysiologiska förhållanden i vitroanvänder vi en enkel 3D kollagenmatrisen. Kollagen är en av de viktigaste komponenterna i extracellulär matrix (ECM) och har använts i stor utsträckning utgöra 3D matriser. För 3D imaging, är nyligen utvecklade ljus ark mikroskopi teknik (även benämnd som enda plan belysning mikroskopi) skisserat med hög förvärv hastighet, stor genomträngningsdjupet, låg blekning och fotocytotoxicitet. Ljus-ark mikroskopi är dessutom särskilt fördelaktiga för långsiktig mätning. Här beskriver vi en optimerad protokollet hur man konfigurerar och hantera mänskliga immunceller, e.g. primära mänskliga cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och naturliga mördarceller (NK) celler i kollagenmatrisen 3D för användning med ljus ark microscopyen för levande cell imaging och fasta prover. Förfarandet för bild förvärv och analys av cellmigration presenteras. Särskilt fokus ägnas Markera kritiska moment och faktorer för provberedning och analys av data. Detta protokoll kan användas för andra typer av fjädring celler i en 3D kollagenmatrisen och är inte begränsat till immunceller.
Introduction
Den största kunskapen om hur du migrerar celler kommer från 2D experiment1,2,3, som normalt bedrivs i en glas eller plast yta för en kultur/imaging maträtt. En fysiologisk scenario kräver dock, i de flesta fall en 3D mikromiljö, där den extracellulär matrixen (ECM) spelar en avgörande roll. ECM inte bara den 3D-strukturen är nödvändiga för att upprätthålla korrekt cellmorfologi utan erbjuder också överlevnad signaler eller riktad ledtrådar för en optimal funktion av många celler4,5 . Därför krävs en 3D-miljö bättre identifiera cellulära funktioner och beteende i en miljö som bättre återspeglar fysiologiska samband.
I den mänskliga kroppen utöva de flesta celler särskilt immunceller, sina funktioner enligt en 3D scenario. Till exempel aktiverade T-celler patrullera vävnader söker målceller, naiva T-celler vandrar genom lymfkörtlarna i sökandet efter sin cognate antigen-presenterande celler under vilken de migreringsläge och maskiner är anpassade till motsvarande extracellulära miljö3,6,7. 3D kollagen gelen har använts som en väletablerad och välkarakteriserad 3D cell kultur system8,9,10. Vårt tidigare arbete visar att primära humana lymfocyter är mycket rörliga och migrera med en medelhastighet på ca 4,8 µm/min i en 0,25% kollagenbaserade matrix11. Ombildning av cytoskelettet spelar en nyckelroll i cell migration12. Ackumulerande bevis visar att lymfocyter gäller inte bara en enda läge migrationens ännu kan växla mellan vissa migration beteende beroende på läge, närmiljön, cytokiner, kemotaktisk övertoningar, och extracellulära signaler som tune den flyttande beteende i olika sätt 3.
För att tillförlitligt analysera immunceller funktioner och beteende, exempelvis migration, utstick bildandet eller vesikulär transport, är det av stor fördel att kunna förvärva bilder i relativt stora 3D volymer i ett snabbt och tillförlitligt sätt. För 3D imaging erbjuder nyligen utvecklade ljus ark mikroskopi teknik (även benämnd som enda plan belysning mikroskopi) en tillfredsställande lösning13,14. Under imaging förvärv, genereras ett statisk ljus tunt för att belysa provet. På detta sätt, på fokus planet, kan ett stort område belysas samtidigt utan att det påverkar cellerna som off-plan. Denna funktion möjliggör en hög förvärv hastighet med en drastiskt minskad blekning och fotocytotoxicitet. I den här artikeln beskriver vi hur att visualisera primära mänskliga immunceller med ljus ark mikroskopi och analysera migration i 3D scenario.
Protocol
Representative Results
Discussion
De flesta i vitro analyser utförs på en 2D yta, till exempel i cellkultur plattor, petriskålar eller på coverslips, medan i vivo celler, särskilt immunceller, uppleva mestadels en 3D mikromiljö. Nya bevis visar att migrationsmönster av immunceller skiljer sig mellan 2D och 3D scenarier17. Dessutom skiljer också uttrycket profiler av tumörceller i 2D – och 3D-odlade vävnader18,19,20</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Institutet för klinisk hemostas och transfusionsmedicin för att tillhandahålla givarens blod; Carmen Hässig och Cora Hoxha utmärkt teknisk hjälp. Vi tackar Jens Rettig (Saarland University) för den modifierade pMAX vektorn, Roland Wedlich-Söldner (universitetet i Münster) för den ursprungliga LifeAct-Ruby-bygga och Christian Junker (Saarland University) för att generera den LifeAct-mEGFP konstruktion. Detta projekt har finansierats av Sonderforschungsbereich 1027 (projektet A2 till B.Q.) och 894 (projektet A1 till M.H.). Mikroskopet ljus ark finansierades av DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
