Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Summary

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Abstract

As feridas crônicas se desenvolvem como resultado da regulação defeituosa em um ou mais complexos processos celulares e moleculares envolvidos na cicatrização adequada. Eles impactam ~ 6,5 M pessoas e custo ~ $40B/ano nos EUA sozinho. Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, questões fundamentais permanecem sem resposta. Recentemente, nós desenvolvemos um modelo novo do rato para as feridas crônicas do diabético que têm muitas características de feridas crônicas humanas. Usando DB/DB^-/- camundongos, podemos gerar feridas crônicas induzindo altos níveis de estresse oxidativo (os) no tecido da ferida imediatamente após o ferimento, usando um tratamento único com inibidores específicos das enzimas antioxidantes catalase e glutationa peroxidase. Estas feridas têm níveis elevados de OS, desenvolvem o biofilme naturalmente, tornam-se inteiramente crônicos dentro de 20 dias após o tratamento e podem permanecer abertos mais por mais de 60 dias. Este novo modelo tem muitas características de feridas crônicas diabéticas em humanos e, portanto, pode contribuir significativamente para o avanço da compreensão fundamental de como as feridas se tornam crônicas. Este é um avanço importante porque as feridas crônicas nos seres humanos causam a dor e a aflição significativas aos pacientes e conduzem à amputação se não resolvidas. Além disso, essas feridas são muito caras e demoradas para tratar, e levam a perda significativa de renda pessoal para os pacientes. Avanços neste campo de estudo através do uso de nosso modelo de ferida crônica pode melhorar significativamente os cuidados de saúde para milhões que sofrem esta condição debilitante. Neste protocolo, nós descrevemos em grande detalhe o procedimento para causar as feridas agudas para tornar-se crônico, que não foi feito antes.

Introduction

A cicatrização de feridas envolve processos celulares e moleculares complexos que são regulados temporalmente e espacialmente, organizados em estágios seqüenciais e sobrepostos que envolvem muitos tipos de células diferentes, incluindo mas não limitados à resposta imune e à do sistema¹. Imediatamente após a pele sustém uma lesão, fatores e células sanguíneas agregado ao local da ferida e iniciar a cascata de coagulação para formar um coágulo. Depois que a homeostase é conseguida, os vasos sanguíneos dilatam-se para deixar no local da ferida o oxigênio, os nutrientes, as enzimas, os anticorpos e os Fatores Quimiotáticos que quimioatraem polymorphonucleocytes para cancelar o leito da ferida de restos extrangeiros e secretam enzimas proteolíticas ². as plaquetas ativadas secretam uma variedade de fatores de crescimento para estimular os queratinócitos na borda da ferida para re-epitelizar a área ferida. Monócitos recrutados para o local da ferida diferenciam-se em macrófagos que bactérias fagoocitose e neutrófilos mortos e secretam fatores adicionais para manter os sinais proliferativos e pró-migratórios de queratinócitos. Na fase de proliferação, enquanto a re-epitelização continua, novo tecido de granulação composto de fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos e células endoteliais continuam o processo de reconstrução². A angiogênese é estimulada pela promoção da proliferação e migração de células endoteliais, resultando no desenvolvimento de novos vasos. A epitelização e a remodelação da matriz extracelular constroem uma barreira contra o meio ambiente. À medida que a ferida cicatrizar e o tecido de granulação evolui para uma cicatriz, a apoptose elimina células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais sem causar dano tecidual adicional. A resistência à tração do tecido é reforçada por fibroblastos remodelando vários componentes da matriz extracelular, como o colágeno, de modo que o tecido recém-formado é quase tão forte e flexível como a pele não ferida².

Qualquer desvio desta progressão altamente concertada para o fechamento da ferida leva a feridas danificadas e/ou crônicas³. As feridas crônicas são caracterizadas pelo aumento do estresse oxidativo, inflamação crônica, microvasculatura danificada e matriz de colágeno anormal na ferida⁴. Estresse oxidativo, especialmente na ferida, pode atrasar o fechamento da ferida^2,5. Quando, na primeira fase da cicatrização de feridas, a fase inflamatória torna-se regulamentada, o tecido hospedeiro assume extensos danos devido a um influxo contínuo de células inflamatórias⁵ que liberam enzimas citotóxicas, um aumento nos radicais livres de oxigênio, e mediadores inflamatórios não regulamentados, resultando em morte celular^6,7.

Neste microambiente destrutivo, bactérias formadoras de biofilme aproveitam os nutrientes do hospedeiro e contribuem para o dano do tecido hospedeiro². Estes biofilmes são difíceis de controlar e remover porque as substâncias poliméricos extracelular hidratadas compor das proteínas, do ADN, do RNA, e dos polisacáridos permitem que as bactérias abrigaram dentro para ser tolerantes às terapias antibióticas convencionais e iludir o resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro^2,8,9.

Estudar feridas crônicas é crucial porque impactam ~ 6,5 milhões pessoas e custam ~ $40000000000 por ano nos EUA sozinhos¹⁰. Pacientes com diabetes têm aumentado os riscos para o desenvolvimento de feridas crônicas que necessitam de amputação, a fim de conter a propagação da infecção. Estes pacientes têm um risco de mortalidade de 50% dentro de 5 anos da amputação que é atribuída ao mecanismo da patofisiologia do diabetes¹¹. A relação entre o sistema imunológico do hospedeiro e o microbioma na cicatrização de feridas é um tema vital da pesquisa em andamento, pois as conseqüências de feridas crônicas, se não resolvidas, incluem amputação e morte¹².

Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, ainda não está claro como e por que as feridas crônicas se formam. Experimentos para estudar os mecanismos de cicatrização prejudicada é difícil de conduzir em seres humanos, e os especialistas em cicatrização de feridas só vêem pacientes com feridas crônicas que já atingiram cronicidade por semanas a meses. Assim, os especialistas são incapazes de estudar o que os processos deu errado que levam a ferida a desenvolver para se tornar crônica². Há uma falta de modelos animais que recapitulam a complexidade das feridas crônicas humanas. Até que nosso modelo estêve desenvolvido, nenhum modelo para estudos crônicos da ferida existiu.

O modelo de ferida crônica foi desenvolvido em camundongos com mutação no receptor de leptina (DB/DB^-/-)¹³. Estes camundongos são obesos, diabéticos, e têm dificuldades de cicatrização, mas não desenvolvem feridas crônicas¹⁴. Níveis de glicose no sangue média em torno de 200 mg/dL, mas pode ser tão alto quanto 400 mg/dL¹⁵. Quando altos níveis de estresse oxidativo (SO) no tecido da ferida são induzidos imediatamente após o ferimento, a ferida torna-se crônica¹⁶. As feridas DB/DB^-/- são consideradas crônicas por 20 dias e permanecem abertas por 60 dias ou mais. Biofilme produzido por bactérias pode ser visto desenvolvendo início três dias após o ferimento; um biofilme maduro pode ser visto 20 dias após ferir e persistir até qualquer fechamento da ferida. As bactérias formadoras de biofilme que encontramos nesses camundongos também são encontradas em feridas crônicas diabéticas humanas.

O estresse oxidativo é induzido pelo tratamento das feridas com dois inibidores de enzimas antioxidantes, catalase e glutationa peroxidase, duas enzimas com a capacidade de quebrar o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio e pode causar danos celulares através da oxidação de proteínas, lipídios e DNA. Catalase cataliza a decomposição do peróxido de hidrogênio em menos produtos químicos nocivos de oxigênio e água. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) inibe a catalase ligando especificamente e covalentemente ao centro ativo da enzima, inativando-o^17,18,19. ATZ tem sido utilizado para estudar os efeitos do estresse oxidativo tanto in vitro como in vivo através da inibição da catalase^{20,21,22,23,24}. A glutationa peroxidase catalisa a redução do peróxido de hidrogênio através do antioxidante, glutationa, e é uma importante enzima que protege a célula contra o estresse oxidativo²⁵. O ácido mercaptosuccinic (MSA) inibe a glutationa peroxidase ligando-se ao local ativo da selenocisteína da enzima com tiol, inativando-o²⁶. A MSA tem sido utilizada para estudar os efeitos do estresse oxidativo in vitro e in vivo , bem como^20,27,28.

Este novo modelo de feridas crônicas é um modelo poderoso para estudar, pois compartilha muitas das mesmas características observadas em feridas crônicas diabéticas humanas, incluindo inflamação prolongada do sistema operacional aumentado e formação de biofilme natural do microbioma cutâneo. As feridas têm a interação cutâneo-epidérmica danificada, o depósito anormal da matriz, a angiogênese pobre e o vasculature danificado. As feridas crônicas se desenvolverão em camundongos machos e fêmeas, de modo que ambos os sexos podem ser usados para estudar feridas crônicas. Conseqüentemente, o modelo crônico da ferida pode contribuir significativamente para avançar a compreensão fundamental de como tais feridas começam. Usar este modelo crônico da ferida pode fornecer respostas às perguntas fundamentais sobre como o cronicidade é iniciado/conseguido com as contribuições da fisiologia da cura danificada da ferida e do microbioma do anfitrião.

Protocol

Todos os experimentos foram concluídos de acordo e conformidade com os regulamentos federais e da Universidade da Califórnia política e procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Riverside IACUC. 1. o animal Use diabéticos e obesos B6. BKS (D)-LeprDB/j camundongos para o modelo de ferida crônica. As opções de compra incluem heterozigotos para reprodução ou homozigotos diretamente para experimentos. Raça heterozygote machos …

Representative Results

A Figura 5 mostra um exemplo de uma ferida sem tratamento de nervos inibidores que progridem para o fechamento da ferida e uma ferida com o tratamento de nervos inibidores que progridem para a cronicidade. A limpeza transparente foi deixada no lugar na ferida crônica de modo que o biofilme e a acumulação fluida possam ser vistos. A iniciação crônica da ferida ocorre em menos de 6 horas e a mar…

Discussion

Uma vez que as feridas crônicas são criadas nos camundongos, o modelo pode ser usado para estudar os processos de cicatrização de feridas envolvidas no início da cronicidade. O modelo também pode ser usado para testar a eficácia de uma ampla gama de produtos químicos e drogas que podem reverter o desenvolvimento de feridas crônicas e cicatrização prejudicada e levar ao fechamento da ferida e cicatrização. Os pontos de tempo diferentes após o início da cronicidade podem ser estudados: por exemplo, …

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers