Detta arbete visar potentialen i tryckta glycan array (PGA) teknik för analys av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar i små djur.
Repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar av en viss individ förknippas ofta med sin immunologiska status. Inte bara enskilda immun skick avgör framgång i kampen mot interna och externa potentiella hot signaler, utan också förekomsten av ett visst mönster av cirkulerande anti-glycan antikroppar (och deras serologiska nivå variation) kunde vara en betydande markör för uppkomsten och utvecklingen av vissa sjukdomstillstånd. Här, beskriver vi en tryckt Glycan Array PGA-baserad metodik som ger möjlighet att mäta hundratals glycan mål med mycket hög känslighet; använder en minimal mängd prov, som är en vanlig begränsning närvarande när små djur (råttor, möss, hamster, etc.) används som modeller till adress aspekter av mänskliga sjukdomar. Som ett representativt exempel på detta synsätt visar vi resultat från analysen av repertoaren av naturliga anti-glycan antikroppar hos BALB/c-möss. Vi visar att varje BALB/c mus deltog i studien, trots att genetiskt identiska och underhållna på samma villkor, framkallar ett visst mönster av naturliga anti kolhydrat antikroppar. Detta arbete hävdar att utöka användningen av PGA-teknik för att undersöka repertoar (särdrag) och nivåerna av cirkulerande anti kolhydrater antikroppar, både i hälsa och under alla sjukdomstillstånd.
Antikroppar spelar en central roll i vårt försvar mot invaderande patogener genom att direkt neutralisera virus1,2 och bakterier2,3, genom att aktivera komplement system4,5 och förbättring av fagocytos6. Dessutom är de väsentliga delarna i cancer inriktning och eliminering av maligna celler7och homeostas underhåll8,9.
Störningar i immunförsvaret kan resultera i autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar10 och cancer11. Alla dessa sjukdomstillstånd kräver helst en snabb diagnos för en effektiv behandling. Vid autoimmuna sjukdomar är serologiska förekomsten av autoantikroppar i de flesta fall en prediktor för diagnostik av autoimmunitet10,12. Dessa antikroppar reagerar med cellytan och extracellulära autoantigener och, de är ofta närvarande i många år innan presentationen av autoimmun sjukdom10,12. Immunförsvar och cancer också diagnosen blodprover att antingen mäta nivån på immun element såsom antikroppar eller deras funktionella aktiviteten11.
Identifiering av repertoaren av cirkulerande antikroppar och deras serologiska nivåer är av största vikt att ställa en prognos och utvärdera utvecklingen av samtliga nämnda patologiska villkor. Vi har tidigare visat potential PGA teknik för analys av cirkulerande antikroppar i olika djurarter13–16, minimera användningen av stora volymer av serologiska prover, undvika problemet i samband med antikroppar korsreaktivitet17 och tillåter hög genomströmning profilering av en bred repertoar av antikroppar15.
Glycan-baserade immunanalyser är främst betingade, bland andra faktorer, av ursprung och produktion av kolhydrater, som bestämmer affinitet och bindning av ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-baserade immunanalyser kan utvecklas i suspension (mikrosfärer)15,21,22 eller platt-aktiverat ytor15,21,22, 23,24. Sist inkluderar ELISA (den mest konventionella metoderna) och PGA. Det finns inte mycket data som jämför dessa metoder i samma experimentella inställning15,25,26,27. Vi har tidigare jämfört effekten och selektivitet av dessa immunanalyser att profil anti-glycan antikroppar i enskilda humanplasma prover15. För vissa antikroppar såsom dessa inriktningsgrupp med anti-A/B blod, alla immunanalyser kunde upptäcka dem med statistisk signifikans och de korrelerade positivt med varandra15,18,21. Samtidigt anti-P1 antikroppar upptäcktes primärt av PGA med högsta diskriminerande effekt, och det fanns ingen korrelation i de avgöranden som fattas av de olika glycan-baserade immunanalyser15,18, 21. dessa skillnader mellan metoderna var främst relaterade till antikropp/antigen-förhållande och glycan orientering15. ELISA och fjädring matriser är mer mottagliga för ospecifik bindning än PGA eftersom det finns ett överskott av antigen över antikroppar i dessa metoder15. Dessutom är glycans i PGA orientering mer begränsat än i ELISA och fjädring matriser15. ELISA är praktiskt när studien omfattar en begränsad panel av glycans. Tillsammans med fjädring matriser erbjuder ELISA större flexibilitet när det gäller assay omkonfigurering. PGA är exceptionellt bekväm för upptäckt metoder15,18,21,28. Trots dessa tydliga fördelar och nackdelar, kunde de tre nämnda immunanalyser användas för att studera olika aspekter av glycan-antikropp interaktioner. Det slutliga målet för studien är den som kommer att vägleda valet av den mer lämplig metoden.
Nuvarande arbete syftar till att utvidga användningen av PGA teknik för analys av repertoaren av cirkulerande anti-glycan antikroppar i små djur. Som representativa resultat presenterar vi här ett detaljerat protokoll för att bedöma repertoaren av naturliga anti kolhydrat antikroppar i vuxna BALB/c-möss av PGA.
Glycan microarrays har blivit oumbärliga verktyg för att studera protein-glycan interaktioner40. Den nuvarande arbetet beskriver ett protokoll baserat på PGA-teknik för att studera repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar hos BALB/c-möss. Sedan PGA erbjuder möjligheten att skärmen stora mängder biologiskt okänd glycans, är det en exceptionellt bekväm upptäckt verktyg13,15,28. Den…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ”Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) bevilja PI13/01098 från Carlos III Health Institute, spanska hälsoministeriet. DB-G var gynnats av en postdoktoral forskartjänst som finansieras av Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt Grant avtal 603049 (TRANSLINK). NK, NS, och NB arbete stöddes av grant nr 14-50-00131 ryska Science Foundation. DB-G vill uttrycka sin tacksamhet till Marta Broto, J. Pablo Salvador och Ana Sanchis för utmärkt teknisk assistans och Alexander Rakitko för bistånd i statistisk analys. Med stöd av den ”Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats jag Recerca del Departament d’Empresa jag Coneixement de la Generalitat de Catalunya (tilldela 2018 DI 021). Vi tackar CERCA programmet / Generalitat de Catalunya för institutionellt stöd.
Antibodies | |||
biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
Equipment | |||
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
Biological samples | |||
BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
Chemicals, Reagents and Glycans | |||
Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
Materials | |||
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
Software and algorithms | |||
ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
kinelmer.com/microarray | |||
Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ |